(―)概述

乙酰膽堿酯酶存在于某些魚類的電器官的神經組織、動物血清、紅細胞和視網膜中， 眼鏡蛇毒和海蛇毒中也含有此酶。由于乙酰膽堿酯酶在神經傳導方面的重要作用，早在本 世紀初期就受到生化工作者的注意。關于動物組織中乙酰膽堿酯酶的純化及其性質的研 究已有大量報道和綜述。動物組織或細胞中的乙酰膽堿酯酶都是以不溶的形式存在。提 取這些酶首先必須把該酶從顆粒上溶解下來，常采用表面活性劑和高鹽溶液處理，但是這 樣處理后的酶有些在離開原來體系后有聚合現象，還可能導致酶的細微結構變化。蛇毒中 的膽堿酯酶是一種可溶性的酶，因而對它的純化可免去這些處理，使用更為溫和的手段， 對用這種方法純化的酶進行研究可能更接近酶的天然狀態。

蛇毒中的乙酰膽堿酯酶較先由Iyenger等(1938)在眼鏡蛇毒中發現。以后的研究表 明這種酶只在海蛇毒和眼鏡蛇毒中存在，響尾蛇毒和蝰蛇毒中極少有這種酶。Nachman- sohan (1942)發現眼鏡蛇毒顯示的乙酰膽堿酯酶活性比電鰻組織中該酶活性高100倍。 過去曾認為這種酶與眼鏡蛇毒的神經毒性有關，但用電泳法把眼鏡蛇毒和金環蛇毒的膽 堿酯酶與其他組分分開后，發現膽堿酯酶不再具有神經毒性。現在已知道眼鏡蛇毒的神經 毒性由其中的神經毒素引起，與乙酰膽堿酯酶無關，乙酰膽堿釀酶的功能還有待于進一步 研究。

該酶按下列方式催化乙酰膽堿酯水解：

CH3 0 CH3

CH3—N+—CH2—CH2—o—c—CH3 —- CH3—N+—CH2—CH2—OH + CH3COOH

/ 

ch3 ch3

(二)分離、純化和理化性質

在Iyenger等（1938)在眼鏡蛇毒中發現乙酰膽堿酯酶后，Zeller等（1948)進一步研 究證明這種酶主要存在于眼鏡蛇毒中，而響尾蛇毒和蝰蛇毒中沒有這種酶。人們已經對多 種眼鏡蛇的蛇毒中乙酰膽堿酯酶進行了純化，并研究了它們的物理化學性質，其中包括: 金環蛇 、銀環蛇 、眼鏡蛇丹山亞種（.和眼鏡蛇外里海亞種 。

過去對N. 和 蛇毒中乙酰膽堿酯酶的純化多使用Na2S04 和（NH4)2S04分步沉淀，后來，Kumar等（1973)用DEAE-Cellulose離子交換和親和層 析相結合的方法對該酶進行純化，獲得了純品。Kumar所用的親和膠為聯接有三甲基- (m-氨基苯-)-氯化銨的Sephar0Se4B凝膠，用這種方法純化 蛇毒中的乙酰 膽堿酯酶的獲得率高達59%。

5. 蛇毒中的酶在2℃?4℃條件下貯存幾個星期不影響活性，一16°C冰凍保存也穩定。該酶的分子量大約為126 000,可被8mol/L尿素(含lmol/LNaCl)分離成 兩個大小相同的亞基,說明這個酶是寡聚酶。利用氨甲酰試劑鄰-硝基苯-二甲基氨基甲酸 滴定乙酰膽堿酯酶，發現每個酶分子活性部位有二個，這與上述結果相同；采用負染色電 子顯微鏡法觀察從凡蛇毒中分離出的乙酰膽堿酯酶，發現基本亞基是圓形的， 直徑5.0nm，亞基可以聚合形成四聚體，但最經常觀察到的是二聚體。該酶的氨基酸組成 已經被分析出來，有趣的是竟與電鰻乙酰膽堿酯酶的組成相似。從蛇 毒中分離出的乙酰膽堿酯酶的最適pH為8. 5,浙江蝮蛇 蛇毒中該酶的最適pH為7. 5。兩者的最適反應溫度都在38X：?40'C范圍內。純酶不僅水解乙酰膽堿， 而且水解其他酯類化合物，包括乙酰硫膽堿（Km=16. 6X10_6m0l/L)、乙酰-J3-甲酰膽堿 (516. 6umol/L)、丙酰膽堿（33. l)umol/L)、醋酸苯酯（1. 14mmol/L)和靛醋酸苯酯（33. lmmol/L)。該酶較好的底物是乙酰膽堿，其次是乙酰硫膽堿。在底物濃度過高時，酶的活 性受抑制，也能被DFP毒扁豆堿、咖啡因（咖啡堿)和嗎啉抑制。三甲基-(m -乙酰苯胺)碘 化胺是金環蛇毒乙酰膽堿酯酶的競爭性抑制劑(Ki = 76.7um0l/L)。

我國余微明等（1981)用親和層析法對浙江眼鏡蛇毒乙酰膽堿酯酶進行了純化。純化 后的酶活力比粗毒提高了 440倍，比活力達到230mmol/mg . h。親和吸附劑的制備是以 Sepharose 4B為載體，己二胺為手臂，（間-羧基苯基)-二甲基乙基碘化銨為配基制成。不 同長度的“手臂”對酶的吸附有影響，烷基越長，吸附得越牢，疏水性強的“手臂”對酶的吸 附也強。屈賢銘等(1981)對該酶的理化性質進行了研究，發現其反應的最適pH為7. 5,反 應5min時的最適溫度在38°C?39€之間，Km值是1.25mol/L，稀酶溶液不穩 定，0. 1%的白明膠有利于酶的穩定。粗毒和純化后的膽堿酯酶的底物抑制圖形以及Km 值類似，這說明純化過程中酶沒有矯變。分離的酶能被多種有機磷化合物(如DEP、敵敵 畏、對氧磷)所抑制，一些氨基甲酸酯和含季銨鹽的化合物也表現出抑制作用。從浙江眼鏡 蛇毒中分離出的乙酰膽堿酯酶是由幾種同工酶組成的，用Sephadex G-200凝膠過濾可以 把這種酶分成兩個對稱的酶活力峰，而且與蛋白峰完全吻合。用凝膠電泳后經蛋白染色可 見3條左右蛋白帶，酶染色可見6條帶。即使兩次親和層析后的制品仍然如此，免疫擴散 和免疫電泳也都說明了同一結果。邱雪貞等(1984)證明，這些同工酶并非由于在提純或電泳過程中產生的矯變,而是原來就存在于粗毒中的。實際上，眼鏡蛇科蛇毒乙酰膽堿酯酶 有同工酶早有報道，Lee等人用凝膠電泳法測定從黑唇眼鏡蛇（蛇毒 中分離出的乙酰膽堿酯酶，發現有2條同工酶帶;從眼鏡蛇  金環蛇 

 蛇毒中測有4條同工酶帶，在等電聚焦中分別為8條、10條。這些同工酶 分子量相同，只是電荷不同。浙江眼鏡蛇毒無論是蛇毒干粉或純化得到的酶，在凝膠電泳 上都可分離得到6條帶。6條帶之間分子量可能并無顯著差別，而只是電泳行為不同，至 于不同形式膽堿酯酶結構和功能的關系尚待進一步研究。

Tan等（1988)從紫棕烙鐵頭 蛇毒中部分純化出一種乙酰膽堿酯酶。該酶分子量為58 600,其活性能被毒扁豆堿和水楊酸鹽強烈抑制。如底物濃度過 高，也能部分抑制其活性。紫棕烙鐵頭蛇毒中乙酰膽堿酯酶的含量不少于0.3%。過去認 為響尾蛇毒和蝰蛇毒不含乙酰膽堿酯酶，Tan等的發現是一種特例。除此之外，Bhat- tacharya和Gaitonde也在鋸鱗蝰蛇毒中發現并部分純化了乙酰膽堿酯酶。

(三） 不同來源乙酰膽堿酯酶的比較

早期，Mounter等（1951)和Augustinsson等（1951)指出，眼鏡蛇科蛇毒中的膽堿酯 酶類似于動物組織中的乙酰膽堿酯酶。Kumar等（1973,1975)以金環蛇 蛇毒作為材料、Java等（1976)、Raba等（1979)和Kesvatera等（1979)以外里海亞 種眼鏡蛇 蛇毒為材料純化膽堿酯酶并研究了它們的性質。他們認為蛇 毒乙酰膽堿酯酶的底物專一性與高等動物紅細胞中的酶十分相似，蛇毒酶分子形態則與 魚電組織或其他高等動物組織中的酶相似。然而蛇毒酶的分子量小，它的結構顯然比其他 動物組織膜上的酶簡單。金環蛇和外里海亞種眼鏡蛇兩種蛇的蛇毒酶相比較，性質也有不 同，例如以乙酰-P-甲基膽堿作為底物時，金環蛇毒酶不表現底物抑制活性，而眼鏡蛇毒酶 則明顯地有底物抑制現象，說明這兩種酶至少在構型方面有差別。余微明（1981)研究浙江 眼鏡蛇的乙酰膽堿酯酶性質，發現該酶與一些典型的膜乙酰膽堿酯酶有不少共性。例如水 解乙酰膽堿比水解其他膽堿酯快，能被某些有機磷、氨基甲酸酯及一些所謂真性酶抑制劑 所抑制，酶活力能被高濃度底物抑制。但它是一種非膜的可溶酶，不像膜上的酶容易聚合， 與腦中的酶、魚中的酶沒有免疫交叉反應，因而可能具有它獨特的結構特征，也就是說它 們之間沒有共同的抗原決定簇，因而也說明抗原決定簇和酶的活性中心不在同一個部位。 抗原抗體絡合后仍能進行酶顯色也說明了抗原決定族和酶活性中心不在酶分子的同一部 位。

(四） 生理作用

早期有些工作者認為蛇毒中的膽堿酯酶是蛇毒毒性的主要部分，但并無實驗證據。 1960年Yang等用區帶電泳法從臺灣眼鏡蛇等幾種蛇毒中分離出膽堿酯酶，觀察到具有 蛇毒毒性的部分并不是膽堿酯酶的活性部分，所以他們認為蛇毒的毒性與膽堿酯酶無關。 60年代后期對蛇毒多肽毒素’的分離研究闡明了蛇毒的毒性問題，但是有些工作者仍認為 蛇毒中的膽堿酯酶對蛇毒的毒性有配合和輔助作用。近年來，前蘇聯科學家用CD42抑制 外里海亞種眼鏡蛇毒膽堿酯酶的活力，發現蛇毒的毒性下降，在蛇毒的神經毒素I中加入 膽堿酯酶能增強蛇毒的毒性?？傊坨R蛇科蛇毒中含有非常豐富的膽堿酯酶，但其生理 意義目前尚不明確。屈賢銘等（1兆1)對浙江眼鏡蛇毒生物毒性測定的實驗結果是與

Yang的工作一致的，但也有若干可供探討的地方。在親和層析柱流出液中還含有少量的 膽堿酯酶，是否與蛇毒的毒性有關，有待進一步研究。以純化的膽堿酯酶腹腔注射4只小 白鼠，每只用量為500Mg，4只全部死亡，是膽堿酯酶本身的毒性，還是在此酶中尚含有其 他雜質所致呢？這種雜質是蛇毒的毒素蛋白還是其他的大分子成分呢？這些問題尚待進 —步探討。

從眼鏡蛇外里海亞種 蛇毒中發現有乙酰膽堿酯酶抑制因子，這種因子對乙酰膽堿酯酶有抑制作用，其活性可以被多種陽離子可逆地抑制，0. 06mol/L的 Mg2+作用最強。已經知道這種抑制因子就是該蛇毒中的心臟毒素。它雖然能強烈抑制蛇 毒中乙酰膽堿酯酶的活性，但對哺乳動物體內的乙酰膽堿酯酶沒有影響。