蛇毒中其他活性物質(zhì)相比，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)是最令人費(fèi)解又感興趣的一類物 質(zhì)。現(xiàn)在已經(jīng)知道NGF是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化的物質(zhì)，有時(shí)對(duì)感覺(jué)神經(jīng)組織的生 長(zhǎng)和分化也有一定的作用。從蛇毒中發(fā)現(xiàn)NGF是非常偶然的，有人觀察NGF對(duì)神經(jīng)生 長(zhǎng)的刺激作用，方法是把能產(chǎn)生NGF的鼠肉瘤細(xì)胞180移入發(fā)育3天的雞胚體內(nèi)，當(dāng)時(shí) 沒(méi)有搞清NGF的本質(zhì)，設(shè)想可能是蛋白質(zhì)或核蛋白。為了證實(shí)是否為核蛋白，實(shí)驗(yàn)中把 具有核酸外切酶活性的蛇毒粗組分加入到雞胚內(nèi)，目的是除去核酸，以便確定NGF是否 為核蛋白，結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)所加的蛇毒組分本身含有NGF。

NGF分布很廣，各種哺乳動(dòng)物組織都有這種物質(zhì)，其中雄鼠額下腺中NGF的含量最 高。現(xiàn)在知道眼鏡蛇毒和蝰蛇毒中NGF的含量比響尾蛇毒中的含量髙,海蛇毒中沒(méi)有 NGF活性。NGF在蛇毒中的含量很難精確測(cè)定，約在0. 5%以下，但比一般組織高得多。 其他動(dòng)物毒如蜂毒、蝎毒、蜘蛛毒和蟾毒都沒(méi)有NGF這種物質(zhì)。

NGF —般不具有酶的活性，僅少數(shù)幾種具有蛋白酶和RN酶活性，但這些活性似乎 與NGF的功能無(wú)關(guān)。有的試劑或條件可以使酶的活性消失，但NGF的生物學(xué)活性仍存 在。純的NGF沒(méi)有毒性。

(―)響尾蛇毒NGF

所有響尾蛇毒似乎都含有NGF，其中對(duì)東部菱斑響尾蛇和食魚(yú)蝮蛇毒NGF a研究得較多。最初對(duì)NGF的分離純化以蛇毒為材料。純化過(guò)程包括硫酸銨沉淀和DEAE-Cellul0Se、DEAE-Cellulose層 析。分離過(guò)程中特別要先把粗毒溶于7. 5mol/L尿素的lmmol/L NaOH中，并在(TC下放 置90min，然后用(NH4)2S04沉淀。如果沒(méi)有這種處理，在以后的層析過(guò)程中，NGF會(huì)大 量失活。前述處理過(guò)程能引起NGF的氨甲酰化，修飾作用是由尿素中的氰酸鹽雜質(zhì)引起 的，這種修飾作用使NGF生物活性在以后的分離過(guò)程中不易喪生。經(jīng)上述純化后的NGF 基本上為純品，超離心分析S2。為2. 28，由此推測(cè)出的分子量為20 000。該組分的E= 10. 3，在280nm和260nm處的紫外吸收光比值（280nm/260nm)為1. 3。分析還表明，該 NGF含有1. 6%己糖。純化的NGF的生物活性是鼠肉瘤180細(xì)胞NGF生物活性的1 000 倍。該因子對(duì)熱不穩(wěn)定，在0. lmol/L NaOH 261：條件下處理lh生物活性不變，但原來(lái)具有的RN酶和蛋白酶活性完全消失。它不易透過(guò)半透膜，用RN酶和DN酶處理也不會(huì)失 活，但用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶處理會(huì)使生物活性降低或喪失。Banks等 (1968)用另一種方法純化出的蛇毒NGF的性質(zhì)與Cohen等(1959)純化的NGF不太一樣。Angeletti等對(duì)毒NGF進(jìn)行了純化，并研究了它的物 理化學(xué)性質(zhì)。對(duì)蛇毒NGF純化過(guò)程比較復(fù)雜，似乎有幾種NGF存在，讀者可參見(jiàn)原文。Angeletti等同時(shí)還對(duì)美洲矛頭蝮蛇毒NGF進(jìn)行了分 離和研究，其分離方法與分離蛇毒NGF相似。純化后的NGF用凝膠過(guò)濾法測(cè)定分子量時(shí)發(fā)現(xiàn)所得組分不是單一的，但主要成分的分子量為30 000。除上述3種響 尾蛇毒外，下列響尾蛇的蛇毒中的NGF也得到了純化或部分純分:西部菱斑響尾蛇(C. aZmr)、銅頭複、紅口竣和矛頭竣。前3種蛇毒僅用Sephadex G-100對(duì)其進(jìn)行層析，雖然層析圖譜各不相同，但其 NGF活性都在20 000?40 000分子量的范圍內(nèi)出現(xiàn)，這說(shuō)明響尾蛇毒中NGF的分子量 大小有相似性 蛇毒 NGF 可經(jīng) DEAE-Cellulose、Sephadex G-100 和 QAE A-25層析得到純化，用凝膠電泳和氨基末端測(cè)定仍不是純品，含有Ser和Gly兩種氨基 末端，其中活性組分的分子量為34 000,等電點(diǎn)為10. 5。有趣的是如用神經(jīng)氨酸酶處理分 離出的NGF后，原來(lái)所有蛋白電泳帶電泳速度均改變30%左右，這種變化可能與分子中 唾液酸被去除有關(guān)，所以說(shuō)A蛇毒NGF是一種糖蛋白。用QAE A-25、SPC-25和Sephadex G-100對(duì)蛇毒中的NGF進(jìn)彳了分離純化后，再用凝膠電泳 檢測(cè)此分離出的NGF發(fā)現(xiàn)仍不純，其中2種主要成分的等電點(diǎn)分別為8. 0和9. 0。與蛇毒NGF相似，它們約含12%的糖，其中包括N-乙酰葡萄糖、葡萄糖、甘露 糖和半乳糖。用凝膠過(guò)濾法測(cè)其分子量為35 000,而用SDS-PAGE測(cè)定其分子量為 19 000,這說(shuō)明NGF可能以二聚體的形式存在。

(二）蝰蛇毒NGF

蝰蛇毒中也含有NGF，其中對(duì)圓斑蝰蛇毒NGF研究得較多。從該蛇毒中純化的NGF在pH3. 8和pH5. 2條件下用圓盤(pán)電泳法測(cè)定為一條蛋白帶，等電點(diǎn)為 10. 5,用超離心和凝膠過(guò)濾法測(cè)定其分子量分別為37 000和34 000,分子形狀為長(zhǎng)形，軸 比為1 : 7,分子沒(méi)有聚合現(xiàn)象。這種NGF較大的特點(diǎn)是含有20%的碳水化合物，其中包 括4個(gè)果糖、8個(gè)甘露糖、9個(gè)半乳糖、14個(gè)N-乙酰葡萄糖胺和2個(gè)N-乙酰神經(jīng)氨酸。分 子中含有大量的谷氨酰胺和天門(mén)冬氨酰胺，屬堿性蛋白。Banks等（1968)在對(duì)蛇毒NGF研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該毒NGF有3種，等電點(diǎn)在9. 5?11. 0之間，沉降系數(shù)分別 為2. 92、2. 83和2. 88,分子量分別為42 000、38 000和39 000,它們的N-端都含有組氨酸 殘基。從蛇毒中分離出的NGF相當(dāng)穩(wěn)定,0. lmol/L HC1或0. lmol/L NaOH 不會(huì)引起失活，也不被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、DN酶和RN酶水解，對(duì)EDTA透析也不 影響其生物活性，但胃蛋白酶或9CTC加熱，15min可以使其生物活性全部喪失。Bailey等 (1975)從沙蝰蛇毒中分離的NGF用凝膠過(guò)濾法測(cè)定分 子量為34 000,等電點(diǎn)為8. 5。盡管用凝膠過(guò)濾法測(cè)定為純品，但氨基末端測(cè)定含有多種 氨基酸,其中含量最多的是異亮氨酸。這種NGF的含糖量高達(dá)32%,其中包括3. 2%甘露 糖、2. 8%半乳糖、13. 8% N-乙酰葡萄糖胺和7. 5%的唾液酸。May等（1959)和Mohamed等（1971)分別對(duì)毒蝰、鋸鱗蝰和彩鋸鱗蝰蛇 毒NGF進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，后兩種蛇毒中NGF的含量較高，而蛇毒NGF的含量較少。

(三）眼鏡蛇毒 NGF

在眼鏡蛇毒中，印度產(chǎn)的眼鏡蛇蛇毒含NGF較多，而且分離也比較容易， 所以在研究蛇毒NGF的性質(zhì)時(shí)多以此毒中的NGF為材料。蛇毒NGF容易分離 的原因在于它對(duì)pH的變化不敏感，對(duì)許多變性劑也有抗性。分離蛇毒NGF — 般通過(guò)兩步就達(dá)到目的，          第一步使用Sephadex C-25凝膠過(guò)濾，          第二步用CM-Cellulose 進(jìn)行離子交換層析。純化后的NGF用沉降平衡法測(cè)定其分子量為28 000,用SDS-PAGE 法測(cè)定分子量為13 000,這說(shuō)明該分子是由2個(gè)相同或相似的亞基組成，其他實(shí)驗(yàn)也證明 是由2個(gè)相同的亞基組成。毒NGF的等電點(diǎn)為6. 7,這可能因?yàn)榉肿又泻兴嵝?nbsp;糖的緣故，它的分子大小、氨基酸組成以及在體內(nèi)外的生物學(xué)活性都與鼠頜下腺的NGF 相似。

從其他眼鏡蛇如黑頸眼鏡蛇.黑唇眼鏡蛇綠曼巴蛇毒中也純化出了 NGF。其分離、純化過(guò)程相似，都是先用Sephadex G-50凝膠過(guò)濾，然后用SP-Sephadex C-25離子交換層析。對(duì)于從 毒NGF的純化還要經(jīng)過(guò)          第三步——Sephadex G-100凝膠層析。這3種來(lái)源的NGF都不 十分純凈。從蛇毒中純化的 NGF分子量分別為22 000、22 000和34 000,等電點(diǎn)分別為9. 0、8. 0和10. 0,它們的含糖量均 小于2%，甩神經(jīng)氨酸酶處理不影響其電泳特性。

雷少波等（1981)采用 Sephadex G50、CM-Cellulose 32 及 Sepharose 6B 柱層析，自中 華眼鏡蛇毒中分離出神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)。經(jīng)3種不同類型的聚丙烯酰胺凝膠電泳及免 疫鑒定證明純化的NGF為單一組分。此NGF經(jīng)9天雞胚背根神經(jīng)節(jié)體外培養(yǎng)證明具有 促進(jìn)神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的活性。經(jīng)Sepharose 6B凝膠過(guò)濾及SDS凝膠電泳測(cè)得其分子 量分別為27 000及13 700,故推測(cè)中華眼鏡蛇毒NGF可能由2條分子量相同的肽鏈組 成。NGF的等電點(diǎn)為7.1，氨基酸組成與印度眼鏡蛇毒NGF部分相似。用體外整體神經(jīng) 節(jié)培養(yǎng)法鑒定NGF活性時(shí)，純化的中華眼鏡蛇毒NGF在培養(yǎng)基中濃度為0. 0lMg/ml時(shí) 可使神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)達(dá)較大速度。這一濃度與小鼠頜下腺NGF及印度眼鏡蛇毒 NGF所需濃度一致。在不純時(shí)，印度眼鏡蛇毒NGF活性受毒素的抑制而不能促進(jìn)神經(jīng)節(jié) 神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)。而中華眼鏡蛇毒NGF即使在粗毒狀況下也表現(xiàn)出生物學(xué)活性。這可能 因不同地區(qū)蛇毒中各種組分含量不同，因而對(duì)于NGF生物學(xué)活性影響不同。采用 Sepharose 6B柱層析測(cè)得中華眼鏡蛇毒NGF的分子量為27 000,而采用SDS凝膠電泳 測(cè)得NGF的分子量為13 700,故推測(cè)中華眼鏡蛇毒NGF也可能由2條分子量不相同的 肽鏈組成，但有待于氨基酸順序分析證實(shí)。

從NGF的氨基酸組成結(jié)果看，中華眼鏡蛇毒NGF與蝰蛇毒NGF及小鼠頜下腺 NGF在氨基酸組成上相差較大，但與印度眼鏡蛇毒NGF氨基酸組成卻較近似，這是因?yàn)?nbsp;中華眼鏡蛇與印度眼鏡蛇同屬于眼鏡蛇科，故其蛇毒成分相似。但中華眼鏡蛇毒NGF分 子內(nèi)堿性氨基酸如組氨酸、精氨酸及賴氨酸含量稍多，而天門(mén)冬氨酸及谷氨酸等酸性氨基酸含量稍少，這與測(cè)得NGF等電點(diǎn)為pH7. 1，較印度眼鏡蛇毒NGF等電點(diǎn)為pH6. 7稍 偏堿相符合。