一、測定方法的建立
蛋白質的純化中，70%以上是酶的純化，因此建立蛋白質的測定方法，常常是建立酶 的測定方法。一種有用的酶的測定方法必須符合4個標準:①絕對特異性;②高度靈敏性; ③高度精確性;④經濟簡便。雖然常常有必要對這些標準采取某些折衷辦法，但應該強調 指出，放棄任何實質性的要求會嚴重地限制一個測定方法的普遍應用。對任何測定方法的 根本要求是其特異性，因為大多數酶的測定法是檢測其底物的減少或產物的增多，這就必 須注意確信只有一種酶活性與被檢測的效應有關。例如磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶 的測定。該酶催化如下的反應：
PEP+C02+GDP =OAA+GTP
若以測量PEP的減少或OAA(草酰乙酸)的生成來測定該酶的活性，就可能出現很 大誤差，除非證明下列各種酶活性不存在。例如：
PEP 羧化酶:PEP+HC03- —»OAA+Pi
丙酮酸激酶:PEP+ADP —-丙酮酸+ATP
PEP 羧基轉磷酸化酶:PEP+C02+Pi —-OAA+PPi
這些問題在純化作用的最初階段尤為敏感，因此時隨便哪個反應所需要的底物都可 能存在。確定一種測定方法的特異性，最令人信服的辦法是通過在各種情況下研究對輔因 子的要求和產物的鑒定，因為對于幾乎任何酶都可舉出類似的例子，所以我們必須知道可 以導致某種產物的聚積或底物的利用的各種可能的反應。
在純化的起初階段，大多數酶的活性是很低的，因此測定方法必須高度靈敏。隨著純 化進程的深化，對靈敏度的絕對需要也逐漸降低了，但是，以不靈敏的方法來進行測定，所 用的酶量越大，就越不適用于其他目的。
一種酶測定法的準確度和精密度通常取決于所采用的技術的化學基礎。例如，倘若有 一個測定方法涉及酶促生成的醛與苯肼起作用產生苯腙的反應，這個反應是在pH不適 當的緩沖液中完成的，即pH明顯大于6時進行的，所觀察到的生成苯腙的速度并不準確 地反映酶促產生醛的速度，而是反映生成苯腙的化學反應速度。一個測定法的準確性是反 映測量值與真實值的接近程度，而精密度則是反應同一樣品在兩次測定或三次測定中所 出現的離散情況。例如，假使有一種測定方法作了 10次同樣的測定，所得的實驗值在平均 值的士5%范圍內，那么這個測定方法對于檢測遠低于20%的變化是沒有什么價值的。比 色測定方法特別容易碰到這種問題。
最后還有一點要考慮的是，所用的測定方法要經濟易行。在純化過程中，在每一步驟 之后對所純化的酶的活性都要追蹤檢查，用以追蹤檢查的方法簡易，多半能說明測出的酶 活性與實際上的活性是相近的。
蛋白質純化工作選材是很重要的，選材好，工作進展較快，成績就大;選材不好，工作 進展慢，則成績小，有時甚至造成此項工作不能進行下去。高尚蔭教授根據他半個世紀的 病毒研究工作經驗提出：成功的科學研究工作有3個主要因素，就是材料、技術和人員。可 見研究材料選擇的重要性。一個研究工作者可能有選擇某一要純化的分子的來源的自由， 也可能沒有。如果目的是為了得到大量的某種蛋白質以研究該蛋白質本身，或用作其他研 究，則任意選擇的可能性就很大。如果純化的目的是被研究系統中的一種特殊成分，則選 擇來源的自由就受限制了。不論何種情況,都要考慮怎樣加快純化過程。純化作用實質上 是一種濃縮過程，在純化過程中要分離的蛋白質被濃縮了，而其他的細胞蛋白質則沒有被 濃縮，因此當要分離的蛋白質在總細胞蛋白質中占的份額增加時，它的純化就容易了。選 擇一種好的酶源的關鍵是量。應當尋找含有大量要分離的蛋白質的組織，并且這種組織還 要容易大量得到。在這方面首選者是大家畜如牛、豬、山羊等的臟器。另一個來源是微生 物。許多微生物例如酵母和細菌等容易生長或價錢便宜，容易大量低價購到。
