一、磷脂酶A2的分離純化
現在已經從四科不同種類的蛇毒中分離出多種磷脂酶a2(pla2)，有些已經得到了 結晶。和蛇毒其他組分相比，PLA2的分離要簡單些，很多情況下先經SephadexG-50或 SephadexG-75凝膠過濾，然后過DEAE-Cellulose或CM-Cellulose柱即為純品。雖然有 多種純化這種酶的方法，但總得率都不高,一般為20%?30%。最近有兩種新方法可以純 化這種酶，一種是親和層析法，該方法用Rac-l-(9-羧基)壬基-2-十六烷基甘油-3-磷酯酰 膽堿與HA-Sepharose 4B通過羧基相聯而制成親和載體（稱為PC-Sepharose 4B）。
另一種方法是先用異丙醇(50%)把蛇毒中的大部分蛋白沉淀除去，然后用氯化銣沉 淀PLA2，沉淀的PLA2經過DEAE-Cellulose層析柱進行純化。這種方法簡單，總得率高， 所以比前種方法優點多。
1.親和層析法一切操作都在5°C下進行。把柱（0. 9cmX15cm)用5ml PC- Sepharose 4B 填充，用 10 倍柱體積的 Buffer I 洗，Buffer I 含 50mmol/L pH7. 5 Tris- HC1、25mmol/L CaCl2、0. 2moI/L NaCl 和 lmmol/L EDTA，柱的加樣量為 lOmg 的東 部菱斑響尾蛇粗毒，粗毒用2ml Buffer I溶解，樣品加到層析柱后流下 2. 5ml時停止，放置2h。用5倍柱體積的Buffer I洗，接著用5倍柱體積的Buffer I洗， Buffer n 含有 50mmol/L Tris-HCl 和 50mmo丨/L EDTA pH7. 5。洗脫時流速為 15ml/h， 每管1. 0ml對各管的A28。和PLA2活性進行測定，如圖3-13-20所示。
這種方法得到的PLA2是由二種異構體組成的混合物，如果想把這種組分中的兩種 PLA2分開，可以用DEAE-Cellulose柱層析。這兩種酶的得率為90%，用凝膠電泳證明為 純品。
2.異丙醇沉淀把5g東部菱斑響尾蛇粗毒溶于250ml 0. 05mol/L醋酸緩沖液中，緩沖液pH為5. 25,含有10mm0l/L CaCl2。向這種溶中加250ml異丙醇， 邊加邊攪拌，加的時間控制在30min。力卩完后在4°C下50 OOOr/min離心30min,上面稍混濁 的溶液保留，下面沉淀棄去。向保留的混濁液中加10ml 0. 5m0l/L NaCl(含0. 05mol/L醋酸 緩沖液），混合后放置30min。按上述相同的條件離心，上清液棄去，沉淀用50ml 0.05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0含0. Olmol/L EDTA)溶解。對該緩沖液透析48h，每18h換一次緩 沖液。把透析后的溶液離心，超過濾濃縮至l0ml。濃縮后的酶液上DEAE-Cellulose柱，柱內 凝膠預先用0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8. 0 lmmol/L EDTA)平衡。用指數曲線進行 洗脫，使用有三個容器的梯度儀，前二個容器每個含有400ml 0. 05mol/L Tris-HCl緩沖液 (pH8. 0)，含 1. Ommol/L EDTA 0. 02mol/L NaCl; 第三個容器含有 400ml 0. 05mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH8. 0)，含 lmmol/L EDTA 0. 2mol/L NaCl，洗脫時流速為 50ml/h，用 泵維持恒壓，每管收集5ml，測定每管的A28。值，如圖3-13-21所示。
用這種方法可以把東部菱斑響尾蛇蛇毒中的兩種PLA2分開，且這兩種PLA2和用親和層析法分離得到的PLA2性質相同。
二、擬箭毒神經毒素的分離
一般地說，可以直接通過離子交換分離這類毒素，有時配合使用凝膠過濾效果更好。 原則上各種陽離子交換樹脂都可以使用，但Bi0-Rex-70(也稱Amberlite IRC-50)效果更 好。這里介紹一些較好的方法，供參考。
選擇凝晈顆粒小于400mesh的Bio-Rex-70。由于該膠有極高的交換能力，所以使用 時平衡時間比其他樹脂都要長。由于羧基的含量大，要10倍柱體積的緩沖液通過柱后平 衡才基本完成，這一點和以纖維素或Sephadex為載體的離子交換膠不同，后者所需的平 衡液較少。實驗中把Bio-Rex-70膠懸于5倍?10倍體積0. 2mol/L的醋酸銨溶液中，用2mol/L的氨水或醋酸滴定到PH6. 5或pH7. 3。傾去上層溶液，重復上述過程2次?3 次，直到加醋酸銨后PH改變小于0. 05個單位為止。這種精確的平衡是以后取得較好實 驗結果的基礎。用醋酸銨作為洗脫液，膠的本身就是一個強的緩沖液，PH為6. 5,流出的 溶液pH反映了膠被平衡的情況。當PH低于6. 0時，擬箭毒神經毒素不可逆地吸附到 Bio-Rex-70膠上。醋酸銨易揮發，易在冷凍干燥時除去，它還可以提高毒素的溶解性。
Karlsson等（1971)描述了從亞洲眼鏡蛇知)蛇毒中提取擬箭毒神經毒素的過程，用簡單的Bio-Rex-70離子交換就可以分離出純品或接近純品(雜質含量低于3%)。 這種雜質可以通過Sephadex G-50凝膠過濾除去。這種神經毒也可以用磷酸纖維素、 Sephadex G-50和竣甲基纖維素來分離。
三、激肽釋放酶的純化
許多蛇毒中的激肽釋放酶都得到了純化。純化過程多用DEAE-Cellulose CM-Cellu- lose，或羥基磷石灰柱反復層析以除去激肽酶(破壞激肽的酶)和其他的精氨酸酯酶。大多 數蛇毒都含有二種激肽釋放酶，這兩種酶可以用Sephadex G-75或DEAE-Cellulose柱分 開，二者的區別不清楚，其中一種分子量可能較小。從日本蝮蛇蛇毒分離激肽釋放酶的方法如下。
用pH7. 0,5. Ommol/L醋酸鈉緩沖液溶解粗毒，濃度為100mg/ml，離心除去不溶物。 DEAE-Cellulose柱(3cmX 40cm)用同樣的緩沖液平衡，蛇毒溶液上柱后用穹形洗脫梯度 進行洗脫，混合瓶為1L平衡液，貯存瓶為0. lmol/L醋酸鈉緩沖液，pH為7. 0,洗脫一段 時間后換成0. 2mol/L pH7. 0的醋酸鈉緩沖液，然后再換成0. 5mol/L PH7. 0的醋酸鈉 緩沖液。洗脫時流速為25ml/h，每管9. 5ml，在4°C下收集，激肽釋放酶在 第91? 第120 管內。對激肽釋放酶進行冷凍干燥濃縮至l0ml Sephadex G-75柱(2. 5cmX40cm)脫鹽。
CM-Cellulose柱用5. 0mmol/L醋酸鈉（pH6. 0)緩沖液平衡，脫鹽后的酶液上柱 (1. 5cmX32. 5cm)用直線梯度進行洗脫，類凝血酶先被洗下來，接著下來的就是所需的組 分。該組分不含內肽酶、L-氨基酸氧化酶、PLA2、透明質酸酶、磷酸二酯酶和NAD核苷 酶。純化的激肽釋放酶的精氨酸酯水解活性占蛇毒總精氨酸酯水解活性的10%以上。用 這種方法最后洗下來的組分是具有促凝活性的物質，如圖3-13-22所示。
