一、一級結構

從哺乳動物胰臟、蜂毒和蛇毒中提取的pla2性質相似，都具有對熱和變性劑穩定、 耐酸、酶活性依賴于Ca2+和分子量小的特點。由于上述性質，人們推測它們的結構也相 似。這類分子的分子量都不大(14 000左右）,且為一條肽鏈,這使人們很容易測定其氨基 酸的順序。目前已經成功地對30多種？1^八2的一級結構進行了測定。除此之外還對與PLA2有同源關系的蛋白或亞基進行了測定，它們多為突觸前神經毒素或其中的亞基，例 如泰攀毒素的7鏈和屮銀環蛇毒 素的B鏈。有關PLA2&其同源 蛋白的氨基酸順序可參見Ver- heij等(1981)的綜述文章。

對各種PLA2的氨基酸順序 比較可以清楚地看出，它們是一 類同源的分子，可能來自同一個 祖先基因。有關PLA2中二硫鍵 的測定是以牛或豬胰臟PLA2為 材料進行的，經反復實驗和多次 修改確定這2種PLA2分子中都 有7對二硫鍵。牛胰臟？1^八2前 體的二硫鍵配對情況如圖3-15-4 所示。對蛇毒中PLA2的二硫鍵 配對情況沒有做過太多的研究，

是通過與牛胰PLA2的比較和推 測來確定的。從氨基酸順序來看，

眼鏡蛇毒和海蛇毒中PLA2的半 胱氨酸位置和哺乳動物胰臟 PLA2中的半胱氨酸位置相似，推測它們之間的二硫鍵配對相 同。對于響尾蛇毒和蝰蛇毒中 PLA2而言，第11位和77位上沒 有半胱氨酸，而在50位和C-末 端有半胱氨酸，這2個半胱氨酸 可能形成二硫鍵。Heinrikson(1977)早期在他的著作里把PLA2分成兩類:第一類包括胰臟PLA2、海蛇毒和眼鏡蛇毒 中的PLA2;第二類包括響尾蛇毒和蝰蛇毒中的PLA2。隨著更多的蛋白質順序被測出，發 現二硫鍵的位置排列有例外情況。例如卩-銀環蛇毒素的B鏈與從蛇毒中分離出的PLA2都沒有CySll-Cys77這對二硫鍵，這2種蛋白都來自眼鏡蛇類蛇毒。

PLA2中眾多的二硫鍵使其性質穩定。二硫鍵的正確配對是酶具有活性所必需的。如 果用還原的方法把二硫鍵全部打開，那么酶的活性就會消失。在對還原后的PLA2氧化使 其結構恢復過程中，如條件不當，僅能使部分的活性得到恢復，有時甚至完全不能恢復。用 豬胰臟PLA2做材料，Van SCharrenburg(1980)發現，在對還原后的PLA2重新氧化時， 如沒有蘇糖醇存在，只有35%的酶活得到恢復。作者認為相對低的恢復率是由于二硫鍵 錯誤配對引起的。如果在半胱氨酸和0. 9mol/L鹽酸胍的存在下進行氧化，氧化則有90% ?95%的酶活性恢復。鹽酸胍的作用是增加被還原狀態？1^八2的溶解性。經上述氧化后的 酶和自然狀態下的酶相同。Verheij等(1981)對29種不同來源PLA2的一級結構的差異 進行了計算，發現它們的氨基酸順序平均相差50%，這一數據表明各種PLA2有極大的同 源性。其中Hydrophis類蛇毒的PLA2和澳大利亞虎蛇屬類蛇毒PLA2的相似 性更大。唾蛇和非洲眼鏡蛇在分類上相差較大，這和它們的PLA2順序相差較大相符合。從PLA2順序來看，眼鏡蛇(C0h)蛇毒PLA2和哺 乳動物胰臟PLA2相似，而與蝰蛇毒的PLA2相差較大。很顯然眼鏡蛇和哺乳動物的 PLA2從祖先蛋白開始都只是經歷了有限的突變進化，而且二者在進化過程中是平行的。

比較PLA2的氨基酸順序還發現，在PLA2中有32個氨基酸是絕對不變的，29個氨 基酸可以被性質相似的(分子大小、電荷或疏水性)其他氨基酸代替。如果僅把胰臟pla2 與眼鏡蛇PLA2相比較，則保守氨基酸有36個，可以被相似氨基酸代替的氨基酸高達45 個。保守氨基酸包括起著催化作用的殘基(His48、Asp99)、結合輔因子Ca2+的殘基(Asp49) 或者具有重要的結構功能的殘基(如所有的Cys,5個Gly殘基）。

PLA2與底物結合是疏水性質的分子作用，不管底物是以分子單體形式還是以聚合 的微粒形式。對PLA2活性部位周圍基團的分析有利于弄清PLA2與底物結合的機制。X 射線分析證明牛胰臟PLA2的活性部位周圍有幾個疏水的側鏈。這些疏水側鏈不是包埋 在分子的內部，而是和外界環境接觸，這樣在PLA2分子表面形成了一個可供與脂類底物 結合的疏水區域。對牛胰臟PLA2而言，這個區域的氨基酸側鏈為LeU2、Trp3、LeUl9、 Leu20、Leu31、Lys56、Leu58(Val-Leu-Cal65)、TyrS9、Thr7。。在其他 PLA2 分子中，這些側鏈高 度可變，但一些主要的疏水側鏈是不變的。這個疏水區域含有多個Arg或Lys，但只有1 個帶負電荷的側鏈基團，凈電荷為正，這說明與底物結合不但要有疏水區域，而且正電荷 對結合作用也是十分有利的。對于蛇毒PLA2而言，這種與底物結合相關的疏水區與胰臟 PLA2相似。由于疏水區的側鏈數在10個以上，可以設想個別側鏈發生突變不會影響結 合作用的本質，只能影響結合作用的強弱。

有兩種蛋白具有PLA2結構而無PLA2活性。一種是Notechis I -1，另一種是泰攀毒 素的I鏈。Notechis I -1有結合Ca2+的作用，也能和PLA2的不可逆抑制劑結合。在結 構上Notechis I -1與Elapid蛇毒PLA2結構相似，僅在30位上有一個氨基酸差別，正常

PLA2的30位是不變氨基酸Gly3。，而Notechis I -1的30位是絲氨酸。這一突變的部位 可能和Ca2+的結合有關，因而可以設想，盡管突變沒有改變對Ca2+的親和性，但結合的部 位可能發生了變化，與正常PLA2的結合部位不同。這種差異可能是導致Notechis 1-1 無酶活性的原因。和PLA2相比，泰攀毒素的7-鏈在結構上有幾個突出的特點:①在N-端 多出一個8肽，這和胰臟PLA2的前體N-端相似;②假如15位和19位的半胱氨酸形成二 硫鍵，那么在該分子活性部位的前面有一個附加環，這一環在正常PLA2是沒有的;③該 蛋白鏈的31位為Pro,而正常PLA231位不是Pro,31位柯近這段肽對Ca2+的結合有重 要作用；④在第55位和第68位之間無缺失;⑤有一個多糖鏈結合在Asn7。上，而ASn7。正 好處在活性中心的前面。

胰臟PLA2的前體不能水解以微粒狀態存在的底物，但能有效地分解以單分子狀態 存在的底物。這種差異是由于前體在N-端多了幾個氨基酸殘基。有人報道這段肽含3個 氨基酸，也有人報道含有5個氨基酸，還有人報道含有7個氨基酸。但無論那種情況這段 肽的C-端都是精氨酸。

早在1972年就有人提出PLA2中的a-氨基在分子內部形成鹽鍵，對活性部位的空間 結構起到穩定作用。經測定，氨基的PK值為8. 3?8. 9,這與假設相符。如果用其他氨基 酸取代Ala,，酶的活性會大大下降，這從另一方面說明維持這種鹽鍵的重要性。X射線衍 射證明Ala,確實包埋在分子的內部。其中的a-氨基通過水分子與Asp99形成鹽鍵。

我國對PLA2結構的研究起步較晚,主要工作由陳遠聰等人完成。他們從浙江蝮蛇毒 中純化出酸性、中性和堿性3種PLA2,分子量相近(約14 000)。中性PLA2是突觸前神經 毒素，酸性PLA2是血小板聚集抑制劑，堿性PLA2有極強的溶血活性。在完成了酸性 PLA2的全部氨基酸順序和中性PLA2、堿性PLA2的化端部分順序測定后，他們發現這3 種PLA2的N-端順序非常相似，只有少數氨基酸殘基有變換，可能C-端的差別較大。關于 它們的空間結構以及結構與功能的關系還有待于進一步研究。

二、化學修飾對活性的影響

對PLA2的化學修飾研究已經進行了 20多年，化學修飾的主要目的是弄清酶的活性 部位，從而為徹底弄清酶的催化機制打下基礎。一般地說，如某種殘基被修飾后酶失去 活性，那么這種殘基被定義為必需基團，它是活性部位的組成成分。如經修飾后僅僅使 酶的活性部分下降，或者僅使結合某種底物的特性改變，這種被修飾的基因可能僅是較 重要而已，談不上是必需基團。在測定PLA2活性時，用以單分子狀態存在的磷脂為底物， 一方面是因為以這種形式為底物時，PLA2只要有活性就能測定出來，反應了它水解底物 的活性大小；另一方面是如用微粒狀態的磷脂為底物，會出現這樣的情況：即某種修飾 劑作用于PLA2某種特殊殘基后，這個殘基盡管不是活性中心的組成成分，也會導致酶活 的全部喪失。這種修飾作用把PLA2轉變成和前體相似的物質，雖然對微粒狀態的底物無 活性，而對單分子狀態的底物仍有分解作用。這種現象可能是由于修飾作用影響了 pla2 中與微粒狀態底物結合的部位的性質，使之不能與底物結合，而不是修飾了分解底物的 活性中心。

(一） 絲氨酸

各種有機磷化合物如DFP都不能抑制PLA2的活性，這說明活性部位沒有絲氨酸存 在。過去有人考慮到PLA2的活性部位含有較多的疏水氨基酸，所以改用疏水性較大的絲 氨酸修飾劑進行修飾。但以乳化形式或以變性劑混合成微粒形式的上述修飾劑都不能使 豬胰臟PLA2失活。現在普遍認為絲氨酸不是PLA2活性部位的組成成分。這和以牛胰臟 PLA2為材料進行的X射線分析結果相符，X射線分析發現牛胰臟PLA2的活性部位無 絲氨酸。曾有人報道DFP可以抑制從蛇毒中分離的PLA2的活性，這種抑 制作用可能不是作用于絲氨酸殘基所致。

(二） 巰基

由于PLA2中的半胱氨酸都形成了二硫鍵，故一般認為PLA2的活性部位沒有巰基。 過去曾有人報道某些巰基修飾試劑可以改變pla2活性，這可能是由于這些修飾劑與巰 基以外的基團作用的結果。

(三） 組氨酸

1966年就有人估計組氨酸可能是PLA2的活性部位組成成分。以后用對-溴苯甲酰甲 溴(BPB)作修飾劑證明了這一點。更詳細的研究發現，豬胰臟PLA2和它的前體PLAZ對 BPB反應的動力學相似，說明這2種蛋白質被修飾的是同一種殘基。當修飾作用使酶活 性下降到原活性5%以下時，氨基酸分析結巣表明1分子pla2減少了 1個組氨酸，用 PLA2前體作試驗也有相似的結果。分析還表明，用BPB做修飾劑時，它主要與紐?結 合，其次是(約10%)與His115結合。用沒有His115的馬胰臟PLA2為材料，發現BPB只能與 His48結合，說明HI48是BPB最易修飾的組氨酸殘基。經修飾后PLA2對任何狀態的底物 都無催化作用。

Ca2+是PLA2絕對需要的輔助因子，無論PLA2還是它的前體都需要與Ca2+結合。 Ca2+能夠阻止BPB對PLA2的修飾作用，但Mg2+對此無影響。除了 Ca2+外，PLA2的競爭 性抑制劑(D型卵磷脂）、PLA2的水解產物（溶血卵磷脂和脂肪酸）以及不可分解的磷脂 類似物都能阻止BPB的修飾作用，特別是Ca2+和單體狀態的D型卵磷脂同時存在時，阻 止作用更強。上述阻止物除Ca2+外，濃度都必須在各自的能形成微粒的臨界濃度以下，否 則有時會加強BPB的修飾作用。這說明PLA2可能和上述分子狀態底物形成了復合物， 這種復合物對BPB穩定。PLA2和聚集狀態的物質很難形成復合物,這可能是在該條件下 BPB仍能起修飾作用的原因。

PLA2和它的前體對修飾劑BPB的反應相似，都能被某些物質和Ca2+保護。從這些 情況來看，PLA2的活性部位在前體形式就已經存在，酶原形式PLA2也能水解單體狀態 底物進一步說明了這個問題。各方面的證據還說明PLA2比前體多了 1個與脂-水界面結 合的部位，由于這種原因，前體PLA2不能水解聚合狀態的底物(Volwerk，1979)。

各種證據表明祕348是PLA2活性部位的組成成分。測定BPB修飾豬胰臟PLA2時pH 的影響，發現祕348的pKa為6. 2,牛胰臟PLA2 His48的pKa為6. 8,在相同條件下牛胰臟 PLA2被BPB修飾的速度是豬胰臟PLA2的10倍。PLA2被修飾時，單體狀態的底物類似 物可以阻止修飾反應，PLA2對它們的親和力與其中的脂酰基長度有關，一般地說脂酰基 長，親和力大。這些證據說明His48可能處在疏水區域，BPB也是疏水性修飾劑，His48所處的

環境有利于BPB的修飾作用。在很多情況下修飾作用使酶失去了水解底物的能力，但對某 些底物的結合作用仍存在，這說明PLA2和底物結合的部位與活性部位是有區別的。

用BPB修飾蛇毒PLA2和突觸前神經毒素的工作起步較晚。與胰臟PLA2相似，它們 與BPB作用時也有一個組氨酸被修飾。對突觸前神經毒素修飾后，這些毒素的PLA2活 性和神經毒性全部消失，這說明完整的活性部位是維持這二種活性的前提。Crotoxin含有 1個酸性A亞基和一個具有PLA2活性的堿性B亞基，完整的Crotoxin不與BPB作用， PLA2活性和神經毒性也不受影響。如B亞基單獨與BPB作用，則自身的PLA2活性和神 經毒性都喪失，但仍然能像修飾前那樣與A亞基結合。分析發現B亞基中的一個His被 BPB修飾。Crotoxin不被修飾可能因為A亞基對B亞基的活性部位有保護作用。Taipox- in毒素有3個亞基，其中a、卩亞基和PLAZ同源，而7亞基和豬胰臟PLA2前體同源。a、(3 亞基和BPB反應都有1個His被修飾，但7亞基不被修飾。在7亞基的活性部位有1個糖 鏈，可能這個糖鏈阻止了 BPB對7亞基的修飾作用。由于用BPB修飾后Tapoxin毒性大 大降低而抗原性仍存在，所以在實驗室中常利用這個特性制備Taipoxin的髙效價抗體。 對BPB修飾的組氨酸位置分析表明，絕大多數也發生在His48位置。

Ca2+也能阻止BPB對絕大多數蛇毒PLA2的修飾，但Crotoxin的B亞基例外，即使 在25mmol/L濃度下，Ca2+也不起作用。與胰臟PLA2相似，Notexin和P-Bugarotoxin被 BPB修飾后失去了對Ca2+的結合能力，但印度眼鏡蛇、黑頸眼鏡蛇和唾蛇蛇毒中PLA2經修飾后活性雖然喪失，但 結合Ca2+的能力仍然存在。PLA2底物類似物有些能阻止BPB對蛇毒PLA2的修飾，有些 不能，從目前情況來看，還不能得出普遍性結論。

(四）色氨酸

用N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)修飾東部菱斑響尾蛇蛇毒PLA2發現，每個二聚體形式的PLA2分子有2個色氨酸殘基被修飾，修飾作用導致PLA2的失 活和其他光譜特性方面的變化。盡管在修飾過程中PLA2有可能發生解聚，但修飾后的產 物仍是二聚體。用2-羥基-5-硝基芐基溴（HNB)修飾東部菱斑響尾蛇

蛇毒PLA2時，每個分子的二聚體PLA2也有2個色氨酸被修飾，不過修飾后 活性仍然存在，光譜方面的特性也沒變。由于每個PLA2單體有3個色氨酸，所以1印31和 NBS修飾的色氨酸可能不同（Heinrikson，1977)。Viljoen等（1976)用NBS修飾加蓬咝蝰蛇毒中的PLA2，他們發現酶活的喪失與Trp31被修飾有關。Ca2+和十六脂 酰膽堿(diC16PC)幾乎不能對抗NBS的修飾作用，但以微粒狀態存在的溶血卵磷脂，特別 在有Ca2+存在時，確實能夠阻止對Trp31的修飾。雖然Viljoen曾經認為丁印31是PLA2的 活性部位組成成分，但以后他又解釋說Trp31可能與底物結合有關，這一解釋和大多數 PLA2Trp31部位的氨基酸可變相符合。在其他許多PLA2中，          第31位不是色氨酸而是其他 氨基酸。從加蓬咝蝰蛇毒中分離出的PLA2可以被鄰-硝基苯磺酰氯 (NPS)修飾，修飾作用主要集中在Trp7。殘基上，活性沒有改變。如果條件劇烈些可以進一 步引起Trp31被修飾，活性也相應地有些下降。經過NBS修飾后的PLA2還可以被NPS 修飾。豬胰臟PLA2 的Trp31被NPS修飾后，如用以微粒狀態的底物辛脂酰卵磷脂測試， 活性沒有變化;但如用卵黃為底物，則活性只有原來的一半。

從半環扁尾蛇蛇毒中可以分離出4種PLA2,其中有3種 PLA2          第70位上無Trp，這3種PLA2的活性比另一種PLA2的活性低。Yoshida以          第70 位上有Trp的PLA2為材料，用NBS對Trp7。進行修飾，發現修飾后PLA2酶活有較大程 度的下降，修飾后產物的活性和前3種PLA2相似。有趣的是修飾后產物水解底物的動力 學也發生了變化，與70位沒有Trp的PLA2相似。Howard和Tmag(1977)報道用NBS 修飾卜銀環蛇毒素后，產物的神經毒性和PLA2活性均消失。Howard和Truag都可以對 印度眼鏡蛇(iV. na知蛇毒中的PLA2進行修飾，修飾的殘基仍是Trp,修飾后酶的 活性絕大部分都有較大的下降。這些PLA2分子中有3個分子的Trp殘基，現在還不知道 是否對這3個Trp都有修飾作用。這種修飾可能通過改變PLA2對底物的結合作用而使 酶失活。

(五） 甲硫氨酸

從東部菱斑響尾蛇細蛇毒中分離出來的PLA2可以與2-溴乙酰 胺-4-硝基苯酚作用，結果修飾了 PLA2中間的1個甲硫氨酸Metlo,當每摩爾PLA2單體 結合0. 75mol對-硝基苯酚基團時，酶的活性仍然存在。馬和牛胰臟PLA2以及豬胰臟 PLA2都只有一個甲硫氨酸Met8，對這些PLA2羧甲基化只能引起活性極小的降低，進行 長達22h修飾后，仍有65%的酶活存在。但當有8mol/L尿素存在時，豬胰臟PLA2失活 的速度要快得多。失活的酶對微粒或單體形式的底物都無作用。直接結合試驗表明失活 的PLA2不能和脂-水界面結合，但仍能和單體狀態的底物類似物以及Ca2+結合，只不過 結合強度要弱而已。過去認為Met8是與識別底物有關的基團，但X射線衍射分析證明牛 胰臟PLA2的Met8包埋在分子的內部，這說明上述判斷很可能有誤。

豬胰臟PLA2除厘《8以外在20位還有1個Met2。，在沒有尿素存在的溫和條件下， Met2。就可以很快被羧甲基化，而在這樣的條件下Met8幾乎不被修飾。Met2。被修飾后， PLA2活性降低一半，對修飾的時間延長并沒有使豬胰臟PLA2失活加劇，但對Met2。的羧 甲基化在增加，用甲基碘作為修飾劑時也有類似的情況。用修飾方法可以制備出S-羧甲 基-Met2。豬胰臟PLA2和S-甲基-Met2。豬胰臟PLA2。這2種修飾產物對單體狀態底物的 水解活性沒變，對單體狀態底物、Ca2+以g微粒狀態的PLA2底物類似物的親和力也不 變，但對底物單分子層的穿透能力大大降低。S-羧甲基-Met2。豬胰臟PLA2對卵黃的水解 能力只有原來的一半。綜合各方面材料，現在認為Met2。和Met8可能是與底物結合有關的 基團。

(六） 賴氨酸

Viljoen(1977)以加蓬咝蝰蛇毒中的PLA2為材料，先用5'-磷酸吡哆 醛修飾,然后用氫硼化鈉還原，結果酶的活性喪失。他認為Lys是PLA2的活性部位組成成 分。微粒狀態的溶血卵磷脂可以阻止上述試劑對Lys的修飾，但Ca2+對此無影響。修飾作用 發生在4個Lys上，每種被修飾的程度大約25 %。從修飾反應的一級動力學來看，修飾作用 不涉及其他基團，否則就會使動力學性質不是單一的一級反應。當每個PLA2分子和1個 5'-磷酸吡哆醛分子結合后，酶的活性即消失,因此普遍認為修飾作用在活性部位進行。

可以先對PLA2吡哆醛化，然后用3H-標記的氫硼化鈉還原來制備放射性的卩-銀環蛇毒 素，制備后的卩-銀環蛇毒素活性沒有變化，但對神經組織結合的解離常數增加10倍左右。

(七） 羧基

Zhelkovskii等（1978)用N-重氮乙酰基-N'-(2,4-二硝基苯基)-亞乙基二酰胺(DBE) 修飾iVajan. oriana蛇毒中的PLA2，修飾反應體系中有Ca2+存在。當每個以二聚體存 在的PLA2分子中1個羧基被修飾后，酶對L-丁脂酰卵磷脂（L-diC4PC)的水解作用完 全消失。二氨基吖陡是PLA2的一種競爭性抑制劑，這種抑制劑和Ca2+都不能阻止上 述修飾作用。修飾后用氫硼化鈉還原并對修飾產物分析，發現修飾作用具有選擇 性。

為了獲得關于活性部位以及和Ca2+結合部位是否有羧基的知識，Fleer (1981)用水 溶性的修飾劑1-乙基-3-(N，N-二甲基)氨基丙基碳化二亞胺(EDC)和氨基脲作為修飾劑 對牛胰臟PLA2的羧基進行修飾，結果發現除八印99或Asp39不被修飾外，其他的羧基都可 以被修飾，修飾后產物失去酶的活性，也失去結合Ca2+的能力。在有Ca2+存在下，除Asp39 和Asp99不被作用外，Asp49也不被修飾。Asp49不被修飾的蛋白質仍具有酶的活性，也能結 合Ca2+。這樣看來Asp49是結合Ca2+的基團，這種結論和用X射線對牛胰臟PLA2的分析 結果相符合。從pH對牛胰臟PLA2結合Ca2+的影響來看，pKa為5. 25,這一數據和Asp49 與Ca2+結合有關這一假設相符合。

(八） 精氨酸

Vensel和Kantr0witZ(1980)用苯甲酰甲醛為修飾劑，證明豬胰臟PLA2活性部位中 有1個精氨酸殘基。用該修飾劑時，大約每分子PLA2有1個Arg被修飾，但這種數量上 的關系不明顯，酶活性降低的程度好像也不與修飾Arg數量的多少絕對相關。Ca2+不能 阻止修飾作用，但以微粒狀態存在的化合物n-烷基磷酯酰膽堿則有阻止作用。當pH從

6. 5升高到9. 5時，酶被修飾的速度加快，但上述底物類似物阻止修飾的效率下降。已知 苯甲酰甲醛有轉氨作用，反應甚至比修飾Arg還快。自由氨基的存在對酶與底物結合及 酶活是很重要的，上述修飾作用的結果到底由轉氨引起還是由對Arg修飾引起是應該搞 清楚的。VerSel(1980)極力證明失活作用確實由修飾Arg引起，但仍然有反對意見。2,3- 二丁二酮和1,2-環己二酮對精氨酸的修飾比苯甲酰甲醛更專一，這2種物質即使在較大 濃度下也只能引起酶活性較小的降低。Verheij(1981)發現，苯甲酰甲醛既有修飾Arg的 作用，也有轉氨作用，修飾Arg的數量依苯甲酰甲醛的濃度大小而定。如果苯甲酰甲醛的 濃度低于Vensel(1980)所用的濃度，可以使豬胰臟PLA2失活。失活的PLA2對CNBr裂 解敏感。CNBr裂解后，PLA2在1^-端少了一個8肽,對除去8肽的PLA2進行氨基酸分析 發現，Args減少80%，Alai幾乎全部消失。把豬胰臟經e-脒化的PLA2的氨基先保護起 來，然后進行修飾，最后把保護基團除去，結果發現修飾后產物仍有很大的活性，Fleer 用14C標記的1，2-環己烷二酮在硼酸鹽存在下修飾豬胰臟PLA2的Arg，盡管有些PLA2 發生轉氨反應，但仍然能分離出只在Args位上發生修飾反應的PLA2。對這種PLA2的研 究發現，它對單體或微粒狀態底物反應的以及和Ca2+的結合特性沒有變化，和未修 飾前相比，它對微粒狀態底物類似物的親和力增大了，對卵磷脂單分子層的穿透能力也加 強了。

(九） 氨基

在Cu2+存在下，二羥己酸可以使蛋白質中的氨基發生特異的轉氨作用。在這種物質作用下，豬和馬胰臟PLA2都會很快失活，而牛胰臟PLA2卻穩定得多。Ca2+和單體狀 態的PLA2底物類似物對修飾無影響，但以微粒狀態存在的底物類似物卻能有效地阻止 上述修飾劑對豬胰臟PLA2的修飾。為了弄清修飾反應的特異性，使用缺乏氨基的豬胰 臟PLA2前體為修飾對象，以PLA2為對照做平行實驗，結果發現當PLA2活性喪失80% 時，對PLA2前體有15%潛在的活性喪失。由于前體中無a-氨基，所以這種失活是由副反 應引起的，延長反應時間可以加劇前體潛在活力的喪失。由于二羥己酸與精氨酸修飾劑 («、|3二酮）的結構相似，所以不能排除Arg也被修飾的可能性，特別是C-端肽段中的Arg 有可能被修飾，因而阻止了酶原的正常激活作用。對Arg的修飾確實是使前體變質的原 因，被修飾后的產物在PH8. 0條件下貯存能部分恢復潛在活性，而這一條件是有利于 Arg苯甲酰甲醛連接鍵斷裂的。

當在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，轉氨作用會很快使牛、豬和馬的PLA2在 30min?60min內完全失活，而用同樣的條件處理豬胰臟PLA2前體時，前體會被激活成 為PLA2，這種PLA2f再需要進一步激活。

轉氨后的豬胰臟PLA2通過離子交換層析可以被分離出來，和未處理的PLA2相比， 只是a-氨基變成了酮基。這種轉氨后的PLA2由于對微粒狀態底物的結合能力下降，所以 對這種形式的底物水解活性很小，但仍能分解單體形式的底物。從這一點來看轉氨后的 PLA2和原來的PLA2前體相似(在水解底物方面），實際上NMR光譜以及X射線分析都 證明轉氨后的牛胰臟PLA2具有其前體相似的結構。

和胰臟PLA2相似，從西部菱斑響尾蛇.極北蝰和黑

唇眼鏡蛇蛇毒中分離的PLA2在四乙基化尿^存在下與二羥己酸作 用很快就失活，把修飾后的PLA2分離出來測定其性質，結果發現它們對微粒狀態的底物 沒有作用，但能部分地水解以單體狀態存在的底物。轉氨后的蛇毒PLA2對脂-水界面的 親和力比原來下降5倍?10倍，但仍比轉氨后的豬胰臟PLA2親和能力大得多。豬胰臟 PLA2轉氨后親和力小可能與它的N-端正區域有關，而蛇毒PLA2轉氨后親和力仍很高 可能與分子中另外一個疏水區域有關。