化學修飾主要用于弄清蛋白質結構和功能的關系。它僅適用于可以被修飾的氨基酸 功能的研究，到目前為止還無法對纈氨酸、甘氨酸、脯氨酸等進行修飾，對苯丙氨酸的修飾 也很困難。對于不能被修飾的氨基酸，它們在蛋白質分子中的作用只能通過其他方法來研 究。肽的化學合成為研究氨基酸功能提供了一個好方法，但這種合成并非容易，其他方法 還有X射線衍射和各種光譜分析。

(一）對氨基的修飾

乙酰膽堿、D-箭毒塊莖堿、十烴季銨以及其他能與膽堿能受體結合的化合物（包括 拮抗物）都含有正電荷，因此認為突觸后神經毒素中的正電荷也是它們起作用必不可少 的，這樣對氨基的修飾變得十分重要而且有意義。對氨基的修飾方法有多種，可分為三 種類型：①把原來帶正電的氨基修飾成帶負電荷的基團：其做法是先用磷酸吡哆醛與毒 素作用，然后用含有氫硼化鈉的Shiff’s堿還原，這樣可以把氨基修飾成帶負電荷的基團： ②把氨基修飾成不帶電荷的基團。可以用乙酰基化、氨甲酰化、丹磺酰化和硝基苯化的 方法來實現。③保留原來的正電荷。可以用狐基化修飾成仍然帶正電荷的基團。

所有的突觸后神經毒素都含有游離N-端氨基,LyS27、LyS/Arg53和短鏈神經毒素中的 Lys53這些保守或不變氨基酸都含有氨基。對Ly27和LyS/Arg53這兩個位置上氨基的作用 可以通過比較其他這兩個位置上不是這些氨基酸的毒素獲得間接知識。從表3-15-1可 見，有5種毒素的27位不是Lys，其中順序2和順序5?7這4種毒素的27位上被Glu 取代，順序39毒素的27位上被Met取代，這5種毒素的毒性都正常。閱讀以后的論述 后會知道對短鏈神經毒素，LyS27 和Lys53位乙酰基化對毒性影響較大，而對于長鏈神經毒 素影響較小。有兩種長鏈神經毒素較特別，一個是從眼鏡蛇外里海亞種（A^；+an. oxkna)蛇毒中分離的Toxin I，它的53位是谷氨酸，因此含負電荷，這種毒素的毒性 很小；另一個是一種長鏈神經毒素，與Toxin I相似，是從半環扁尾蛇sewz'- 蛇毒中分離的Ls II ,它的53位為天門冬氨酰胺，為中性，該毒的毒性也很小。 Toxin I毒性小主要歸于53位上的這種突變，因為其他部位上的氨基酸與正常的長鏈毒 素相同；LsI的毒性下降部分還歸于其他部位的突變，如31位的Asp被Asn取代，在 C-端缺幾個氨基酸（與一般長鏈毒素相比），而這些氨基酸在正常長鏈毒素中都帶一些正 電荷，這可能也是Ls I毒性下降的原因。

有關氨基的修飾多以Siamensis toxin為材料，該毒素有6個氨基，可以被氨甲酰化、 乙酰化和胍基化。氨甲酰化可以產生單氨甲酰化到六氨甲酰化的6種衍生物，除六氨甲酰 化衍生物外，其他幾種衍生物都有數種異構體，其中只有單氨酰化衍生物的6種異構體可 以通過Bio-Rex-70柱層析得到分離。徹底的氨甲酰化以后，改變了毒素的凈電荷，從原來 在中性條件下帶4個正電荷變成帶2個負電荷，它的毒性由原來的LDlOOug/kg鼠 下降到3 OOO^g/kg鼠，與原來相比只剩下3%的毒性。這種殘存的毒性不是因為污染或 不完全氨甲酰化的結果，因為用氨基酸成分分析和羧甲基纖維素層析都證明是純的六氨 甲酰神經毒素。與未甲酰化前相比，六氨甲酰神經毒素毒性十分低，它的毒性用摩爾表示為DL50 = 0. 37umol/KG鼠，D-氯化箭毒塊莖堿的DUeOJ^mol/kg鼠，所以盡管毒性 已很低，但仍與箭毒相當。六氨甲酰化神經毒素含有2個負電荷，但仍然能與乙酰膽堿受 體結合，對乙酰膽堿受體有親和力而又具有負電荷的物質很少。Siamensis toxin的毒性 隨著被甲酰化程度的增加而降低，對能引起呼吸困難這種病理現象也是如此，六氨甲酰毒 素在某種劑量下可以產生呼吸困難并可維持30min，而未修飾毒素在同樣劑量下可以持 續6h。被修飾的毒素可逆性及作用速度比原來增大，如給鼠注射致死劑量的六氨甲酰化 毒素，30min左右就死亡，而未氨甲酰化毒素6h后實驗動物才死亡。修飾后的毒素在體內 被清除的速度快，一般地說可逆性大的毒素所需的致死劑量都比較大，而且使動物死亡的 速度也快。

Siamensis toxin的6種單乙酰化衍生物的致死劑量都為150/ixg/kg鼠，毒性比未修 飾毒素小2/3,它們與受體的結合特性沒有改變。在6個氨基中，Lys23的氨基對修飾劑最 敏感，1^349的氨基最不敏感，敏感與否是指與修飾劑反應的難易。從蛇毒中 分離的Toxin naja 3毒性與Siamensis toxin相似，其結構順序也高度相似，它有5個氨 基，49位是精氨酸，Toxin naja 3的五氨甲酰化物的毒性比Siamensis toxin的五氨甲酰 化物大3倍，剩下的毒性為原來的20%，而相應的Siamensis toxin修飾物毒性只是原來 的7%，而且是5種氨甲酰化物的混合物。

Erabutoxin b的LD50=120^g/kg鼠，分子類型為62-4,屬短鏈神經毒素。對它進行 酰化產生的單酰化衍生物有5種，可以通過Bio-Rex-70層析分開，對1^827和Lys47分別 乙酰化后其活性分別降低83%和92%，而對其他氨基進行修飾則不影響其毒性。1^827與 修飾劑反應最容易，而Lys4^lj最難。Erabutoxinb的不同單乙酰化物毒性相差很大，這說 明短鏈神經毒素的某些關鍵氨基酸對修飾是敏感的，這種敏感性對于長鏈神經毒素來說 不太強。

Grazyan等（1983)用黑頸眼鏡蛇(".蛇毒中的Toxin a為材料進行單乙 酰化修飾，用離子交換和HPLC可分離出5種單乙酰化修飾物，它們分別是Lys15、Lys27、 1^847、1^851被單乙酰化以及N-端氨基被單乙酰化的產物。另外還獲得N被甲酰化和 Try29被硝基磺酰化的衍生物。C.D譜分析發現這些修飾產物與未修飾前的毒素相比高級 結構沒有多大的變化。但用發射和激發熒光光譜法測定Try29環境的改變情況發現:① LySlJ Lys27乙酰化后對于Tyr25向Trp29能量傳遞的效率分別增加了 10%和30%;② Lys51被乙酰化后，發射熒光光譜的強度增大了 16%;③對Lys47和N-端氨基乙酰化不影 響熒光光譜的性質。用魚電器官乙酰膽堿受體豐富的膜碎片為材料，測定7種修飾產物 與3H-標記Toxin a之間競爭結合的特性，發現自然毒素的KD = 2X10-um0l/L，N-端被 乙酰化的毒素KD = 3X 10_11mol/L，Lys29被乙酰化的毒素KD=7X 10_11mol/L，1^15乙 酰化物的毒素Kc^gXlCTUmol/L，Lys51乙酰化的毒素Kr^gXlO-Umol/L, Lys27乙酰 化的毒素KD = 29X10-nm0l/L，Lys47乙酰化的毒素KDsSZXlO^mol/UTry^被硝基 苯磺酰化的毒素KD^SOXlCTUmol/L。從這些數據可以得出結論，1^327、丁1^29和1^^47是 毒素結合受體重要的氨基酸，但并非是必需的;而LySl5、Lys51和N-端氨基對結合作用的 貢獻很少。

對其他短鏈神經毒素的修飾工作也做了不少。眼鏡蛇毒素(Cobrotoxin)的LD50 =5/ug/kg鼠，分子類型為62-4。對Lys27進行三硝基苯化作用不影響其毒性,但如果硝基苯 化修飾后再對1^853進行修飾則毒性幾乎完全消失。如果4個氨基都被修飾后，則活性只 有原來的2%，它和抗血清反應的能力喪失，這說明毒性的下 降是由于分子構象被攪亂引起的，并不僅僅是加了 2個三硝基苯基后體積變大的原因。 如果單獨對Lys353進行三硝基苯基化修飾，則活性下降很少。Erabutoxin b也有類似的現 象，如分別對1^827和Lys„進行乙酰化毒性下降較小,但如同時對這2個氨基酸殘基進行 修飾則可以引起毒性急劇下降。這也可能適用于其他短鏈神經毒素，因為lys27和lys853是 十分關鍵的。

胍基化對毒性影響甚小，這可能因為胍基化沒有改變氨基的電荷特性。對Siamensis toxin的5個Lys進行胍基化，毒性僅下降50%。對眼鏡蛇毒素的3個Lys進行胍基化， 其活性沒有影響，把剩下的N-端氨基進行三硝基苯化其活性仍不變。

Erabutoxin a、Erabutoxin b和Erabutoxin c是從同一種蛇毒中分離出的3種突觸 后神經毒素，它們的氨基酸順序十分相似，而且具有相同的致死活性。a和b分子中的氨 基分布相同，c的Lys51缺失，而其他都與a和b相同。對a和b的5個氨基進行胍基化處 理，兩種毒素的毒性都下降了 50%，對c中的4個氨基進行胍基化處理，按理毒性也應該 下降50%，但實際上降低了 85%，這其中的原因目前還無法解釋。

從對氨基的修飾來看，氨基對毒性不是必不可少的，但27位和53位保持正電荷有重 要作用，尤其對62-4型突觸后神經毒素，作用更大。

(二）對精氨酸的修飾

神經毒素在37位都有一個不變精氨酸。在擬箭毒毒素中，除了 N-端都有一個可帶正 電荷的氨基外，Arg37則是另一個都共有的帶正電荷的氨基酸基團,再其他的正電荷都不 是共有的，都具有一定的局限性。人們肯定會認為Arg37是必需氨基酸，因為其他膽堿能 的配體都具有這種正電荷，但實驗結果似乎不是這樣。眼鏡蛇毒素含有6個精氨酸，用苯 甲酰甲醛與精氨酸殘基反應時，不同位置的精氨酸反應與pH有關。在PH6.0時，Arg28 被修飾，其毒性不變;在pH6. 7時，Arg28和不變氨基酸Arg37被修飾，毒性下降了 75%; 在pH7. 5時，Arg28、Arg3。和Arg37被修飾，毒性還剩3% ;當pH8. 0時，最后一個Arg4。也 被修飾，毒性還剩下原來的2%;八^43和八^67始終不被修飾。

必需氨基酸是指對毒性絕對需要的氨基酸，如對它修飾其活性就會全部消失。Arg37 被修飾后仍有25%的毒性被保留下來，按照必需氨基酸的定義，Arg37應屬于非必需氨基 酸。但也有反對意見，這些人認為:雖然不同Arg被修飾是依賴pH變化的，但在pH7. 6 情況下不可能修飾作用僅發生在八^28和Arg372個精氨酸上，Arg3。和Arg43可能在某種 程度上進行少量的反應。在PH6. 7 27°C下用100倍摩爾數的苯甲酰甲醛與毒素反應lh， 氨基酸分析發現有1.9個精氨酸被修飾，這說明還有一定量的八^37未被修飾，因為這 1. 9個精氨酸中可能有Arg3。和Arg43。這些未被修飾的八印37在pH7. 5和8. 0時反應徹 底，致使剩余毒性降到2%?3%。這種觀點認為毒性最后只剩2%是由于八印37被徹底修 飾的原因，而不是修飾了 Arg3。和Arg43所致。另一方面，與苯甲酰甲醛的反應在中性條件 下是一種可逆反應，因此各種修飾物的剩余毒性與測定前或進入體內后衍生物的去修飾 有關。總之對于Arg37是否為必需氨基酸的問題現在還沒有完全弄清，像這類經修飾后仍

有剩余毒性的殘基很難判定是否是必需氨基酸，要想做判斷還必須進一步研究，其中包括 用更為溫和的修飾劑，把修飾后產物中未被修飾的部分和沒有活性的二聚體除去等，在這 種情況下再檢測是否仍有毒性。

用細菌(Arthrobacter)分泌的蛋白酶可以水解Siamensis toxin的C-端，水解的結果 是從C-端除去二肽、三肽或四肽，當四肽Arg—Lys一Arg—Pro被除去后，毒性從lOOjug/ kg鼠降到200pg/kg鼠，而去除二肽或二肽其毒性降至150ug/kg鼠。Samensis toxin C- 末端的2個精氨酸是非必需氨基酸是可以理解的，因為這種尾端只存在于長鏈神經毒素 中，對毒性的影響不大。在長鏈毒素中有一種叫“短缺毒素”的物質，分子類型66-5,它也 沒有這個堿性尾巴，但毒性與其他正常長鏈神經毒素相似。Toshia (1987)對長鏈突觸后 神經毒素a-Bungarotoxin和Laticauda colubrina b的C-端尾巴的作用進行了研究。它用 羧肽酶P把這兩種毒的C-端切去4個?5個氨基酸殘基，然后用核磁共振和C. D譜測定 毒素結構變化的情況，結果發現除去C-端幾個氨基酸對分子構象沒有大的改變，也就是 說，長鏈突觸后神經毒素的C-端對肽鏈高級結構的維持作用不大。但競爭結合試驗發現， 去除C-端肽段的2種毒素與受體結合的強度變小，這可能是由于C-端的堿性基團直接與 受體相結合。

(三） 對羧基的修飾

眼鏡蛇毒素有7個羧基，其中6個都可以被甘氨酸甲酯酰胺修飾，修飾作用在水溶性 的碳化二亞胺中活化進行，修飾的羧基包括不變氨基酸Glu31。經上述修飾后其活性降低 了 25%。          第7個羧基Glu21只有在6mol/L鹽酸胍的存在下才能被修飾，但這種修飾作用 伴隨著失活，失活的原因可能由于構象改變，因為被修飾后的衍生物與抗血清反應的活性 也消失。

(四） 對色氨酸的修飾

不變色氨酸的作用吸引了許多科學工作者,在這方面也做了大量工作。Toxin B和 Naja 4結構上與長鏈毒素Siamensis toxin相似，毒性都為LD1(X) = 100fxg/kg鼠，當這3 種毒素在過甲酸中進行臭氧化作用后其毒性保留50%?80%。用2-羥-5-硝基溴苯或2- 硝基-5-羧基苯磺酰氯處理后其毒性的大部分仍然保留。當用2-羥-5-硝基溴苯處理Siamensis toxin 后， 用凝膠過濾和離子交換相結合的方法從中分離出 3 種修飾衍生物 ，其中 有2種衍生物在2個位置上發生了修飾作用，殘存的毒性分別為20%和30%，          第3種衍 生物僅發生了一次修飾作用，殘存的毒性為50%。從眼鏡蛇泰國亞種（見na知 蛇毒中分離的Toxin 7c毒性為LD1(X) = 150fig/kg鼠，分子類型為62-4,把它 用臭氧化處理，然后分離含有N-甲酰犬尿氨酸的修飾衍生物，測定這種衍生物的殘存毒 性為8%。眼鏡蛇毒素和Toxin 7c的順序相似，僅一個氨基酸殘基之差。對這種毒素用幾 種試劑進行色氨酸的修飾，發現毒性下降了 94%?98%這說明62-4型毒素對色氨酸的 修飾比長鏈毒素要敏感。其他的62-4型毒素也有類似的現象，如Embutoxin b用80倍摩 爾濃度的2-羥-5-硝基溴苯處理后毒性下降了 90%。

從埃及眼鏡蛇蛇毒中分離的ToxinaLD50 = 55jug/kg鼠，分子類型為 61-4,對它的色氨酸進行甲酰化處理，其混合物的毒性為原來的50%。這說明對于短鏈毒 素甲酰化作用和其他色氨酸修飾試劑相比作用較小，也可以認為61-4型分子比62-4型分子在結構上有更大的穩定性。

上面已經說過，Toxin 7c經修飾后，分離的N-甲酰犬尿氨酸的修飾衍生物殘存的毒性為 8%。這個數值很重要，根據它可以得出結論:不變氨基酸——色氨酸不是必需氨基酸。對于其 他短鏈神經毒素的修飾物還沒有被分離，一般都用加大修飾試劑來保證修飾完全，殘存的毒性 也少。Karol等(1984)研究了突觸后神經毒素分子表面色氨酸對10-(羧乙基)_黃素的敏感 性，結果表明，短鏈神經毒素Erabutoxin a、Erabutoxin b、Erabutoxin c和眼鏡蛇毒素中的 Trp29對這種化學物質敏感，長鏈神經毒素A-Cobrotoxin和a-Bungarotoxin的Trp29對這種 化學物質也敏感，這說明了印29這個殘基是暴露于環境中的。

對長鏈或短鏈神經毒素的色氨酸、酪氨酸或精氨酸進行修飾后一般都會發生聚積作 用。蛋白質濃度高或分子中導入較多芳香基團會加強這種聚積作用。二聚體或多聚體一 般活性都較低或沒有活性，因此測定活性時應選單體衍生物，這種單體衍生物可以通過凝 膠過濾而分離出來。Siamensis toxin經冷凍干燥可以產生2種不同類型的二聚體，這2 種二聚體可以通過CM-Cellulose柱層析而得到分離。這2種二聚體的毒性相同，LD1OT = 500/xg/kg鼠，以摩爾數計算其毒性為單體的40%。二聚體毒性低，而藥理性質和單體十 分相同。二聚體與受體結合的可逆性差，一旦結合到受體上就不易下來，它可以引起呼吸 障礙達48h,而同樣毒性劑量的單體則只能維持6h。由于二聚體與受體結合緩慢，所以注 射到體內的二聚體可能有一部分在沒與受體結合前就被排出。用N-羧酸-D，L-丙氨酰胺 處理Siamensis toxin,在該分子中引入約70個丙氨酸，這70個丙氨酸組成3個?4個多 肽分布在毒素分子上，每個多肽約20個丙氨酸。這種被修飾的毒素對抗血清仍有作用， 推測也還有神經毒性，因為它可以抑制1251標記的Siamensis toxin與乙酰膽堿受體的結 合。

(五）酪氨酸的修飾

所有神經毒素和大部分膜毒素在25位上都是酪氨酸，只有幾種膜毒素該位置上被 Phe保守地取代。對長鏈神經毒素Toxin B和Siamensis toxin的酪氨酸進行硝基化處理 后其毒性只下降20%?30%。從黑頸眼鏡蛇蛇毒中提取的Toxin a LD100

= 90/ug/kg鼠，分子類型為61-4,對它的25位上酪氨酸進行修飾后其殘存活性仍高達 60%。Toxin TC和眼鏡蛇毒素都含有2個酪氨酸，其中之一是Tyr25，到目前為止還不能 做到只修飾不變酪氨酸而不影響另外一個酪氨酸。這2種毒素經硝基化后構象發生了很 大的變化，從而引起徹底失活，對眼鏡蛇毒素的2個酪氨酸進行碘化作用不影響其活性。 這可能說明碘化作用是一種比硝基化作用更溫和的方法。

不變酪氨酸很顯然對于神經毒素的功能不是必須的，在兩類神經毒素中這種氨基酸 所處的微環境不同。在長鏈毒素中，不變酪氨酸是敏感的，可以在不改變分子折疊狀況 下進行反應，10倍摩爾量的四硝基甲烷就足以完成修飾反應，酪氨酸的pKa值在10. 5? 11. 0范圍內，這個值與游離狀態相近。在短鏈毒素分子中，1 000倍的四硝基甲烷也只能 對不變酪氨酸緩慢修飾，它的pKa在11. 6?12. 0之間，這個數值從另一方面說明不變 酪氨酸在短鏈毒素中不暴露在分子外部。Karol等（1984)研究了突觸后神經毒素中酪氨 酸對10-(羧乙基）-黃素的敏感性，結果表明所研究的神經毒素Tyr25對這種化學修飾劑 不敏感，而Cobrotoxin中的Tyr3_ a-Bungarotoxin中的Tyr55對它敏感。