(一） 核酸內(nèi)切酶
檢測方法：
把3ml底物(含0. 04mg小牛胸腺DNA，用0. 2mol/L pH5. 0醋酸鈉緩沖液配制）和 1ml酶(大約20mg的蛇毒)混在一起，放入37C保溫的分光光度計比色杯中，以水作為空 白，底物作對照，在A26。胃和A33tom處變換著測定并記錄，直到A33teni處的數(shù)值開始大幅度 地增加為止，然后以A2_m測得值對時間作圖。若還沒有得到足夠的點去確定直線時， A33Qmn處的數(shù)值就大幅度增加，必須用再稀釋一些的毒液重新測定。用1 : 75?1 : 110的 稀釋液一般能獲得滿意的結(jié)果，因為在這種條件下，A33_的值在lh?2h內(nèi)能保持相對的 穩(wěn)定。核酸內(nèi)切酶的1個酶單位被定義為lmin內(nèi)，在260nm處增加1個吸收值所需的酶量。
(二） 磷酸二酯酶
方法一(Bjork 等，1963)
原理:雙-對硝基苯磷酸鈣經(jīng)磷酸二酯酶水解后產(chǎn)生對硝基苯磷酸，后者在堿性條件 下，在400nm處有吸收峰。
操作過程:反應(yīng)液含 1. 0ml 0. lmol/L pH8. 9 的 Tris-HCl 緩沖液，1. 2ml 0. OOlmol/ L雙-對硝基苯磷酸鈣和0. 2ml酶液，加水到3ml,在37°C下保溫。保溫一定時間后，加入 3ml 0. 05mol/L NaOH停止反應(yīng)，在400nm處測定吸收值，對照不加酶液。把每分鐘釋放 1/rniol對硝基苯酚的酶活定為1個酶單位。
2.方法二（Bessen，1946)
反應(yīng)系統(tǒng)組成如下:5mg/ml蛇毒溶液配在含有1. 2 X l(T2mol/L MgCl2的0. 05mol/ L甘氨酸緩沖液(pH8. 8)0. 2ml中。
雙-對硝基苯磷酸二鈉或雙-對硝基苯磷酸鈣(配在上述溶液中，調(diào)pH為8. 8)1. 0ml， 反應(yīng)總體積1. 2ml。在37°C保溫5min?40min后，加10ml 0. 02mol/L NaOH停止反應(yīng)， 在420nm處比色，測定對硝基苯酚的生成。
3.方法三（Razzell，1963)
該法除用對硝基苯胸腺嘧啶5'-磷酸為底物代替雙-對硝基苯磷酸鈣外，其他地方和 上述兩種方法相似。反應(yīng)液含lOOfxmol pH8. 9的Tris-HCl緩沖液，0. 5/xmol底物，總體積 為lml。在加待測試液前，混合液應(yīng)在37€水浴中平衡，加酶液后立即在400nm處測吸收 值。每分鐘水解ljumol底物相當(dāng)于1.2個酶活力單位。
(三） 核甘酸酶
方法一（Hepper 法，1955)
5'-核苷酸酶、腺三磷酶、腺二磷酶和核苷焦磷酸酶活力都可以用Hepper法測定。反 應(yīng)系統(tǒng)組成如下:5mg/ml?15mg/ml蛇毒溶液〔配在含有1. 2X 10_2mol/L MgCl2的0. 05 mol/L 甘氨酸緩沖液 0. 2ml 中(pH8. 8)〕，3. 6X10-2mol/L 5'-UMP，或 ATP，或 ADP，或 輔酶I (用上述緩沖液配制，調(diào)pH到8. 8)1. 0ml,反應(yīng)總體積1. 2ml。在37°C保溫2h后加 lml 10%三氯乙酸停止反應(yīng)，放置20min,過濾，取濾液lml按Fiske-Subbarrow(1956)方 法測定無機磷的生成，在660nm比色。
方法二(Suzuki 法，1958)
反應(yīng)液含 0. lml 4;xmol 5'-AMP，0. lml 0. 3mol/L MgCl2,0. 5ml 0. 2mol/L 甘氨酸- NaOH緩沖液(PH8. 5)和0. 2ml酶液，總體積為0. 9ml。在37'C下保溫15min，釋放的無 機磷用Allend法（1940)測定。
除上述方法以外，還可以用以下方法測定5'-核苷酸酶的活性:①用紙層析法測定由 底物水解產(chǎn)生的腺苷的放射活性，這種方法需把底物腺苷酸AMP進行放射標(biāo)記(Murray 等，1969);②在腺苷脫氨酶的存在下，用分光光度計測定腺苷轉(zhuǎn)變成次黃嘌呤核苷的速度 (Ipata，1967);③也可以測定②中氨的產(chǎn)生量(Belfield等，1970;Bootsma,1972);④用14C 標(biāo)記AMP，經(jīng)酶作用后的反應(yīng)液過氧化鋁柱，對分離下來的“C腺苷進行放射測定，未被 作用的底物被吸附到柱子上。
(四） 酸性磷酸酶
檢測方法(Tu等，1966):
這種方法是在H0fstee(1954)工作的基礎(chǔ)上建立的。對照和測定管中都加0. 5ml 0. 0036mol/L的鄰-羥苯基磷酸。對照管中加2. 0ml 0. 15mol/L pH5. 0的醋酸鈉緩沖液和 0. 5ml去離子水，總體積為3. 0ml。這樣最終底物濃度為0. 6mmol/L，緩沖液的濃度為 0. lmol/L，測量管以0. 5ml酶液代替去離子水，酶液混合后在25C保溫，測定因水解釋放 水楊酸而產(chǎn)生的在300nm處的光吸收。調(diào)整蛇毒濃度，至少可將5min內(nèi)各測定值和時間 作圖得出一條直線。把每分鐘水解1/umol底物所需的酶量定為1個酶單位。
(五） 堿性磷酸酶
1.方法一（Sulkowski 等，1971)
用對-硝基苯磷酸為底物，這種物質(zhì)不被5'-核苷酸酶水解，因而避免了這種酶對測試 的干擾。反應(yīng)液含1.0ml 0. lmol/L pH9.5的苷氨酸-氫氧化鈉緩沖液，1.2ml的
001mol/L 對硝基苯磷酸，0. 3ml 1. 2Xl(T2mol/L MgCl2 和 0. lml 酶液，加水至 3.0ml。 在37°C下反應(yīng)15min，加3. OmI 0. 05mol/L NaOH停止反應(yīng)，在400nm處以不加酶的樣 品為對照測光吸收。把每分鐘釋放1/^nol對硝基苯酚的酶量定為1個酶單位。
除上述方法外，堿性磷酸酶還可以用測定磷酸二酯酶活性的Bessey法測定。
方法二
參考 Sigma 改良法及 Bessey 法進行。0. 2% PNPP(pH10. 3,含 Mg2+0. 0025mol/L) lml，酶液 0. 2ml，保溫 25min(37°C)。加 10ml 0. 02mol/L NaOH 終止反應(yīng)。415nm 比色。 查對-硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算酶活力，每個AKP活力單位是上述條件下每分鐘使底物水 解生成l^g分子對-硝基酚的酶活力。
方法三(AKP同工酶的分離鑒定及其等電點測定）
參照喬克強、Coopei.及Gabrie的方法進行。用7. 5%聚丙烯酰胺凝膠做支持物，1% (終濃度)的PH14?10 Ampholine做兩性電解質(zhì)載體進行等電點聚焦電泳。電泳結(jié)束后 取出凝膠，將之置于蒸餾水中漂洗片刻，然后浸泡于酶染液內(nèi)在37°C水浴中保溫30min。 不經(jīng)漂洗酶帶即清楚出現(xiàn)。酶染液組成:在含有25mmol/L a-萘酯磷酸鈉的33mmol/L pH8.5Tris-HCl緩沖液中按2mg/ml?3mg/ml加入G.B. C.，充分?jǐn)噭蚝笫褂谩Ｄz各 節(jié)段pH值的確定:在同一條件下完成等電聚焦電泳的多條凝膠中抽取部分進行酶染色， 部分凝膠則從正極到負(fù)極端按每段0. 5cm切斷。依次把各節(jié)段置于2ml中性蒸餾水中浸 泡過夜，測定各節(jié)段浸泡液的pH值，并據(jù)此繪出整條凝膠從正極到負(fù)極端的pH遞變圖。 根據(jù)酶帶的位置求出各酶帶(同工酶)的等電點。
(六） 核糖核酸酶
檢測方法(McDonald 法，1955):
反應(yīng)系統(tǒng)組成如下：5mg/ml?8mg/ml蛇毒溶液（配在0. lmol/L Tris-HCl緩沖液 中，pH7. 6)0.2ml，1.0ml 7mg/ml酵母RNA溶液（配在上述緩沖液中），反應(yīng)總體積
2ml。在3(TC保溫30min以后，加2. 0ml MacFadyeri試劑停止反應(yīng)，放置30min，過濾， 取1.0ml濾液加1.0ml蒸餾水和6. 0ml 0.2% 3,5-二羥甲苯溶液，在沸水浴中加熱 20min顯色，在680nm比色，測定寡核苷酸的生成量。
作用于磷酸酯的酶類水解底物有交叉現(xiàn)象，因此在測定過程中一定要注意其他磷酸 酯酶的干擾。例如核酸內(nèi)切酶、磷酸二酯酶相互間可以產(chǎn)生干擾。5'-核苷酸酶可以干擾磷 酸二酯酶的測定。在實驗過程中可以通過選擇特定底物、特定反應(yīng)條件等來避免干擾。
(七） 對氧磷酶
檢測方法(Mende等，1975):
反應(yīng)液含0.1ml酶液，50u1 0. lmol/L對氧磷溶液（溶于丙撐二醇）和0.85ml 50mmol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液（含5mmol/L CaCl2)，整個反應(yīng)體系總體積為0ml。在400nm或348nm處記錄消光值來測定水解速度(Armstrong等，I%6)。每分鐘 釋放lMm0l對-硝基苯酚的酶量定為1個酶單位。
