響尾蛇毒和蝰蛇毒含有類凝血酶，特別是蝮亞科蛇毒更以富含類凝血酶著稱。類凝 血酶具有精氨酸酯酶活性，能夠直接作用于纖維蛋白原而使其凝固，其作用結果和人或牛 的凝血酶相似，因而稱之為類凝血酶。對類凝血酶的分離工作做得很多，許多蛇毒中的類 凝血酶得到了純化和部分純化，這里介紹管豐利等(1982)從浙江產蝮蛇毒中分離、純化類 凝血酶的過程。鑒于蛇毒昂貴，有些步驟是為了綜合利用而設的，讀者可根據自己的情況 制訂純化步驟。

1. Sephadex G-25 柱層析為 了綜合利用蛇毒中各種活性組分，

先用Sephadex G-25分離活性小肽 ——舒緩激肽增強因子。取21g粗 毒，共分為7批，每批3g,溶于10ml pH7. 2,5. Ommol/L磷酸緩沖液（內 含0.1mol/L EDTA)中，離心取上 清液上柱（4.0cmX 65cm)，用內含 10—4mol/L EDTA的同一磷酸緩 沖液洗脫，層析圖譜如圖3-13-35 所示。經Sephadex G-25分離后，大 致分為二部分，即先洗脫的大分子 蛋白質及后洗脫的小分子多肽。后者用于提取激肽增強因子，將前者的收集液合并供下一步純化。

DE-11纖維素柱層析將上述合并液直接上事先已用pH7. 2, 5.0mmol/L鱗酸 緩沖液平衡過的DE-11層析柱(4.0crnX95Cm)，然后用不同氯化鈉濃度的同一磷酸緩沖 液分級洗脫。          第一個蛋白峰(No. 15?50)收集后用于磷脂酶A2的制備。具有精氨酸酯酶 活力的峰，經生物活力鑒定， 第一個丶 第二個酯酶峰為激肽釋放酶,但混雜有類凝血酶活 力。第三個酯酶峰為類凝血酶（No. 110?124),突觸前神經毒素位于其后（No. 127? 163)，如圖3-13-36所示。分別合并洗脫液，對蒸餾水透析后冷凍干燥備用。

DE-52層析取上述凝血酶組分凍干物100mg溶于10ml的pH8. 0,5. Ommol/L 磷酸緩沖液中，并用同一緩沖液平衡DE-52纖維素柱(1. 5cmX14cm)。上樣后用不同濃 度的NaCl直線梯度洗脫。層析圖譜如圖3-13-37所示。精氨酸酯酶活力測定顯示有一個 主峰和二個小峰。主峰即為類凝血酶組分。其后的雜蛋白峰呈黃色，很可能是含核黃素輔 基的L-氨基酸氧化酶。合并酯酶活力的主峰部分用飽和硫酸銨反透析沉淀，收集沉淀并 用pH8. 0,5. Ommol/L的磷酸緩沖液透析平衡，再在DE-52纖維素柱上重層析一次，又可 除去部分雜蛋白，如圖3-13-38所不。

Sephadex G-75凝膠過濾將上述純化的類凝血酶20mg 溶于lml0.2mol/LNa- C1、0. 02mol/L NaHC03 中，樣品上于 Sephadex G-75 柱（1. 3cmX150cm)，并以同一溶液 洗脫，可得一對稱的蛋白峰，如圖3-13-39所示。它與精氨酸酯酶的活力峰相吻合。生物活 力測定表明，它能使纖維蛋白原凝固，此即提純后的蝮蛇毒類凝血酶。

提純后的類凝血酶在7. 5%或10%濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳上都呈一條帶。用過 碘酸-Schiff’s試劑作糖蛋白染色也同樣可得到一條粉紅色區帶，位置與蛋白區帶一致，說 明蝮蛇毒類凝血酶為一糖蛋白。

十一、X因子激活劑的分離純化

蛇毒中含有X因子激活劑，但分布不太廣泛，這里介紹Helene Hofmann等(1987)從 矛頭蝮蛇毒中分離X因子激活劑的過程。
 DEAE-Cellulose 層析矛頭峻（5沉<^mr)蛇毒溶于 pH7. 5，10mM Tris- HC1緩沖液中（含5mmol/L Benzamidine)并對該溶液透析。經過透析后的樣品上DEAE- Cellulose 柱，用 Omol/L ?0. 2 mol/L NaCl線性梯度洗脫。

50mmol/L Tris-HCl 緩沖液(含 100mmol/L NaCl 和 5mmol/L 苯甲脒)平衡，洗脫時也用該緩 沖液，在41：下操作，流速為 8ml/h。如圖 3-13-40 和圖 3-13-3. DEAE-Cellulose 柱層析 把圖3-13-38和圖3-13-39中 含有X因子激活劑的組分合并分 別上DEAE-Cellulose柱，可獲得 純的X因子激活劑蛋白。

十二、凝血酶原活化 因子的純化

有些蛇毒中含有凝血酶活化 因子，其中包括鋸鱗蝰 泰攀蛇蛇毒。這里介紹

Frederick等（1980 )從泰攀蛇 蛇毒中分離純化凝血酶激活 因子的過程。

Ultrogel-22 層析取出 100mg 的泰攀蛇（

3ml pH5. 8，0. 05mol/L NaAc (含0. 15mol/L NaCl)中，在 22°C 條件下上 Ultrogel-22 柱（1. 5cm X 100cm)，每管2. 5ml分部收 集，見圖3-13-42。

QAE-Sephadex-Q50 層析 把          第一步分離的          第35?          第45

管收集，在22°C條件下上QAE- Sephadex-Q50 柱（0. 9cm X

30cm)。該柱用 pH5. 8,0. 05mol/L NaAc 緩沖液(含 0. 15mol/L NaCl)平衡，用 0. 15mol/ L?0. 6mol/L直線梯度洗脫，總體積100ml，每管2ml分部收集，如圖3-13-43所示。

十三、血小板聚集誘導因子的分離純化

有些蛇毒組分可以誘導血小板的聚集和釋放，而有些能夠抑制這種反應。血小板聚集 激活因子可以分為兩類：①具有酰胺水解活性的絲氨酸蛋白酶，如從矛頭蝮

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(Soi/iro/^ aimr)蛇毒中分離出的血小板素和從響尾蛇(Crota/奶 Aorr/<it« Linnaeus)蛇毒 中分離的Crotalocytin。②          第二類是非酶類物質。除此之外，還有其他組分如PLA2等也可 以引起血小板聚集。這里介紹Ouyang等(1986)從r/i0<ios<0OTa蛇毒中分離血小 板聚集誘導因子的過程，這種誘導因子可能屬于非酶類物質。

1. Sephadex G-75 柱層析用 pH7. 2,0. Olmol/L 碳酸銨緩沖液平衡 Sephadex G-75 柱(柱體積600ml)，用同樣溶液溶解0.6g粗毒，離心除去沉淀后上柱。用平衡液在4°C 條件下洗脫，流速36ml/h，每6ml收集一管，如圖3-13-44所示。