蛇毒中含有水解羧酯鍵的酶類，水解的底物為磷脂、乙酰膽堿和芳香乙酸酯。這類酶 包括3種:即磷脂酶、乙酰膽堿酯酶和芳香酯酶。蛇毒中的精氨酸酯酶雖然也能水解人工 合成的精氨酸或賴氨酸酯，但它更主要的是水解自然界中的蛋白質肽鍵，所以屬于蛋白酶 類。這里討論的酶類只作用于酯類底物，不能對任何肽鍵起作用。在這類酶中，乙酰膽堿 酯酶和磷脂酶的生物學功能較重要，已得到充分的研究。有些蛇毒有很強的芳香酯酶活 性，它們能水解對-硝基苯乙酯、a-或P-萘乙酸酯和吲哚乙酯。現在還不知道這種活性是由 獨立的酶產生的還是已知的羧酸酯酶的副作用，更不知道這種酶的生物學意義是什么。用 日本蝮蛇 蛇毒與底物對-硝基苯乙酯、吲哚乙酯反應，沒有發現有水解 產物對-硝基苯酚和吲哚酚;相反，這些酯如果與眼鏡蛇舟山亞種 蛇毒和 銀環蛇 蛇毒作用則會很快被水解。已知這些眼鏡蛇毒有很強的 膽堿酯酶活性，水解上述底物可能是由這種酶的作用。事實上，Mclean等(1971)報道，很 多屬于眼鏡蛇科的蛇毒都能水解吲哚乙酯、萘乙酯和萘丁酯，這些蛇毒來自：眼鏡蛇  、黑頸眼鏡蛇 、黑唇眼鏡蛇   、金黃眼鏡蛇  、埃及眼鏡蛇 、眼鏡王蛇  、金環蛇  曼巴蛇黑曼巴蛇和白唇曼巴蛇(D. aw盡現在還知道東部菱斑響尾蛇 

蛇毒能水解甲基吲哚乙酯，這種底物是測定血清中膽堿酯酶活性的底物，但這種 蛇毒沒有表現出膽堿酯酶活性。這說明眼鏡蛇毒中存在一種未知酯酶，它不同于膽堿酯 酶，要想搞清這種酶的本質，還要做進一步的分離工作。

一、磷脂酶A2

(—)概述

磷脂酶是指能夠水解磷酸甘油酯的酶。自然界中有5種磷脂酶，即磷脂酶A2、磷脂酶

A,、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。蛇毒中主要含磷脂酶A2(PLA2)，有極少數蛇毒含磷 脂酶B,其他幾種磷脂酶主要在動物組織和細菌中。圖3-11-4說明了這幾種磷脂酶對底 物水解的作用部位。 

     在磷脂酶中，PLA2研究得較多，它可能是蛇毒中研究最多的一種酶，它的底物為Sn- 3-磷酸甘油酯          第2位上的酯鍵。這種酶廣泛存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒和動物組織中，四科蛇 毒中均含有豐富的PLA2。由于這種酶使紅細胞破裂引起溶血，所以也把它稱為“溶血 素”，也有人把PLA2稱為溶血卵磷脂酶。

Ludeeke首先發現蛇毒通過酶可以對卵磷脂作用產生一種溶血性化合物，后來 Delezenne等人證明當眼鏡蛇毒作用于馬血清或卵黃時形成一種溶血物質。現在知道 PLA2可以直接作用于紅細胞膜的磷脂，破壞紅細胞膜的結構而引起直接溶血作用；也可 以作用于血清或添加的卵磷脂產生溶血卵磷脂,后者作用于紅細胞而產生間接溶血。盡管 四科蛇毒中都含有豐富的PLA2，但各種蛇毒中酶的含量稍有不同，響尾蛇(C.

蛇毒僅僅顯示弱的PLA2活性。表3-11-11例舉了我國10種主要毒蛇蛇毒 PLA2的活性比較。

表3-11-11我國10種蛇毒磷脂酶八2活力的比較

(二）分離和純化

蛇毒中PLA2的含量較大，而且對熱、酸、堿和變性劑穩定，這樣使它們很容易被純 化分離PLA2常用的方法是先對粗毒進行凝膠過濾，然后進行離子交換層析，后一步可 以重復進行。需要注意的是，在離子交換層析后對PLA2進行冷凍干燥應該注意不要引起 的聚集，因為冷凍干燥過程中往往使體系中離子強度增大，而離子強度大是引起 PLA2聚集的重要因素。除上述一般方法外，下面一些方法也有被采用:①Wells等(1975) 用異丙醇和NdCl3沉淀法從東部菱斑響尾蛇 如蛇毒中純化出了 PLA2。②用PLA2的底物類似物為配基進行親和層析。這種配基可以與蛇毒中結合有Ca2+的PLA2結合。洗脫液多采用EDTA，除去Ca2+后的PLA2與配基 的親合力減小，可以從配基上解離出來。也有人用30%的有機溶液或6mol/L尿素作為洗 脫液。③用PheiiylSephar0SeCL-4B進行疏水層析，以除去心臟毒素中的微量PLA2。④ 以抗PLA2的抗體作配基對PLA2進行親和層析。

迄今為止已經有大量的蛇毒PLAZ被純化出來。Tu等(1977)列出了 1975年以前從 蛇毒中純化出的PLA2。近幾年，每年都有大量報道分離、純化PLA2的文章，在這里著重 討論我國學者對PLA,的分離純化工作。

陳遠聰等(1981)從浙江蝮蛇毒中分離出3種PLA2，按其等電點劃分，可分為酸性、中 性和堿性PLA2。按其毒性劃分，毒性較大的是中性PLA2，已鑒定為突觸前神經毒素—— 蝮蛇毒素(Agkistrodotoxin),毒性較低的是堿性PLA2,酸性PLA2幾乎沒有毒性。武祥福 等(1984)比較了 3種PLA2的特性，包括分子量、氨基酸組成、N末端、等電點、熱穩定性、 酶活性、毒性和溶血活性等.結果表明，它們有相似的分子量和熱穩定性，但在其他方面卻 有顯著的差別。在酶活性方面，酸性酶活性較高，堿性酶活性最低;對大白鼠紅細胞的溶血 作用堿性酶最強，中性酶次之，酸性酶幾乎不溶血。因此推測PLAZ的溶血效應與PLA2 分子的電荷有關。張景康等（1981)已經制出了 Agkistrodotoxin的晶體。涂光儔等 (1983)報道從福建產圓斑蝰蛇毒中分離純化了一個等電點為7. 6的毒性PLA£，并測定了 它的部分理化性質、氨基酸組成及N-端22個氨基酸殘基的排列順序。李躍生等(1985)從 福建產圓斑蝰蛇毒中分離純化出另一種PLA2。該PLA2*子量為13 800,等電點10. 4,比 活力為35/xnioI/miri . mg。以卵磷脂為底物，酶的最適pH為8. 0,最適溫度為65°C。小鼠 靜脈注射的LD5。為0. 5士0. 12mg/kg。此酶具有明顯的抗凝性和溶血作用。該毒性PLA2 分子由18種氨基酸的123個殘基組成，分子中富含半胱氨酸(14)、天冬氨酸(14)和甘氨 酸(12)，但只含1個甲硫氨酸，其N末端為絲氨酸殘基。與涂光儔分離的PLA2相比，2種 同工酶的分子量和氨基酸殘基數目十分相近，氨基酸組成也很相似，但天冬氨酸和脯氨酸 殘基的數量有一些差異。廣西眼鏡王蛇 蛇毒含有豐富的PLA2,舒 雨雁等(1989)從該毒中分離出一種PLA2,比活性較原毒提髙3. 6倍，分子量為13 000, 由122個氨基酸殘基組成，等電點為8. 9,具有良好的熱穩定性。從堿性PLA2對紅細胞影 響的電鏡觀察可見，對人的紅細胞膜有明顯的作用，而對山羊紅細胞作用不明顯，該 PLA2無論對人還是對山羊、兔和豚鼠紅細胞電泳速度都有明顯的遲緩作用。Chen等 (1989)最近從尖吻蝮 蛇毒中分離出一種酸性PLA2,用凝膠過濾測 定的分子量為16 900，SDS凝膠電泳測定的分子量為16 400,等電點為4. 9,該酶N端的10個氨基酸順序與從響尾蛇科其他來源的PLA2相似。該酶能抑制由ADP、膠原蛋白和 花生四烯酸鈉誘導的血小板聚集，當PLA2濃度在10/xg/ml?lOOjug/ml時，血小板聚集 徹底被抑制。如果用洗滌的血小板為材料，PLA2在20Mg/ml濃度也不能抑制聚集。阿斯 匹林是環氧酶的抑制劑，可以抑制PLA2對血小板的作用，PLA2可能是通過水解出花生 四烯酸合成血栓素A2來抑制血小板的聚集作用的。用圓二色性、熒光、紫外光吸收等手 段研究了浙江產蝮蛇毒堿性PLA2的溶液構象，實驗結果顯示此酶的主鏈構象和其他種 屬來源的同類酶相似，骨架構象具良好的抗熱性，在酸性環境中產生的構象變化為可逆 的。激活劑Ca2+和酶的結合不影響色氨酸殘基的環境，抑制劑，Zn2+則與此相反。溶液pH 值影響酶活性的方式與上述試劑不同。