(一）概述

激肽釋放酶全稱為舒緩激肽釋放酶，又稱激肽原酶。注射響尾蛇毒引起的明顯作用就 是能降低動物的血壓。Rocha e Silva等（1949)發現美洲矛頭蝮 蛇毒 可以從人優球蛋白釋放一種生理活性物質，并將這種物質稱為舒緩激肽，具有降壓的功 能。由于響尾蛇毒中蛋白水解酶活性很大，所以過去人們認為從激肽原釋放出激肽是由其 中內肽酶作用的結果。后來Deutsch和DiniZ(1955)報道蛋白質被水解與激肽釋放活性之 間沒有確切的關系。Hamberg等（1957)發現 蛇毒即使在100℃加熱 3min?5min后仍然保持釋放舒緩激肽和促凝活性。此后，激肽釋放酶也在哺乳動物的血 漿及某些腺體中找到，分別被稱為血漿激肽釋放酶和組織激肽釋放酶。激肽釋放酶在體內 有重要的生理功能，它不但能釋放激肽，還能激活凝血因子XII而參與凝血反應，與補體系 統也有密切關系。激肽釋放酶釋放的激肽具有使毛細血管舒張、血壓下降、平滑肌收縮和 致痛等強烈的生理效應。激肽釋放酶與激肽原、激肽與激肽酶等共同組成了激肽釋放酶一激肽系統，認清這一系統的作用在理論上和在臨床醫學上也具有重大意義。現在知道所有 響尾蛇毒和蝰蛇毒中都含有激肽釋放酶，這種酶可以作用于血漿中的激肽原而釋放舒緩 激肽。它們與蛇毒中其他精氨酸酯酶和類凝血酶不同，當以合成底物baee，bame和 TAME為底物時，它們的水解活性比精氨酸酯酶和類凝血酶的水解活性要低得多。Oshi- ma等(1969)研究了蝮亞科、蝰蛇科和眼鏡蛇科32種蛇毒的精氨酸酯酶及激肽釋放酶的 活性，指出激肽釋放酶在蝮亞科蛇毒中活力較高。

(二）分離、純化和理化性質

自從1949年Rocha e Silva等人首先在美洲矛頭蝮蛇(£0認ro% jararaca)蛇毒中發 現激狀釋放酶之后，很多學者對蛇毒激肽釋放酶做了大量的分離工作，并對它們的物理化 學性質進行了研究。1965年，Sato等人從日本複蛇蛇毒中分 離純化出激肽釋放酶，并對它的物理化學性質進行了研究。過去還對下列蛇的蛇毒的激肽 釋放酶進行了純化：美洲矛頭蝮 、西部菱斑響尾蛇 、鋸鱗蝰 和加蓬四蝰 。對這些蛇毒中激肽釋放酶的分離多采用 DEAE-Cellulose，CM-CellUl0Se或羥基磷灰石反復層析以除去破壞激肽的酶和其他精氨 酸酯酶。所有上述蛇毒中都含有兩種激肽釋放酶，這兩種酶可以用Sephadex G-75或 DEAE-Cellulose柱層析分開，二者的區別還不清楚，但其中的一種分子量可能較小。

近10年來對蛇毒激肽釋放酶的分離也較多。Bailey等(1976)和Viljoen(1979)從沙 蜂和加蓬啦蜂 蛇毒中分離出了激肽釋放 酶。Sugihara等（1981，1982)對恪鐵頭 蛇毒中激肽釋放酶進行了研 究。王心民等(1984)發現浙江產蝮蛇Pallas)蛇毒中含有激肽釋放酶， 不需活化即可水解激肽原，釋放激肽，并具有弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒經DEAE-纖維 素、DE-22、DE - 52和Sephadex G-75分離純化后，可得到兩個激肽釋放酶的組分：I與 I，二者電泳行為與酶活力有所不同，激肽釋放酶I在聚丙烯酰胺凝膠電泳中呈一條帶， 而組分I中還雜有少量的組分I。激肽釋放酶I為一糖蛋白，含糖量20. 3%，約由221個 氨基酸殘基組成，凝膠過濾和SDS電泳測定其分子量分別為31 000和30 000。此酶具有 嚴格的底物專一性，能作用于激肽釋放酶的專一底物Z-Phe-Arg - MCA及Bz-Pro-Phe- Arg-PA，不作用于一般蛋白質底物酪蛋白，對TAME的水解速度僅是對BAEE水解速 度的14%，以BAEE為底物時,其最適pH為8?9，Km值為2. 85Xl0-4mol/L。pH低于5 或大于9,溫度在40°C以上時，酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽釋放酶的活力均能 被絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF和DFP所抑制，兩者呈平行關系，但都不被胰蛋白酶的專 一抑制劑TLCK所抑制。慈菇抑制劑與大豆胰蛋白酶抑制劑對此酶有部分抑制作用。經磷 酸纖維素等陽離子交換樹脂層析或交聯的慈菇抑制劑Sepharose 4B親和層析也能提純 激肽釋放酶I，但提純后精氨酸酯酶活力下降，激肽釋放活力幾乎全部喪失。經圓二色光 譜測定表明，酶的構象已發生改變。對激肽釋放酶I作用于激肽原后的產物作了鑒定，證 實是舒緩激肽。

Ohtani等(1983)從 蛇毒中純化出一種能引起毛細血管通透性增大的蛋白酶。從4g粗毒中可以純化6. 2mg這種蛋白酶，純化的蛋白質在pH8. 3和PH4. 5條 件下進行PAGE測定為純蛋白，該酶無酪蛋白水解活性和促凝活性，但能水解TAME，說 明具有精氨酸酯酶活性。注射Spg該酶到家兔皮內可以發現毛細血管的通透性增加。0- htaini等(1985)再進一步研究發現這種酶與牛血漿混合，注射到去毛的家兔背部皮內后， 其毛細血管通透性增加的強度比單獨注射該酶大。用50%?70%的乙醇對混合物(酶和 牛血漿)進行抽提后，如果再用羧肽酶A對該提取物進行處理，其活性即喪失，因此認為 這種酶對毛細血管透性的增加作用是由于它作用于牛血漿中的某種蛋白，釋放出小分子 量肽的緣故。沒有發現有其他物質如組胺和過敏素等的釋放，也沒有發現對補體系統有作 用。Ohtani等(1988)對毛細血管通透性增強因子的理化性質作了進一步的研究。研究表 明：該因子用SDS-PAGE測定時分子量為32 000,由266個氨基酸殘基組成，蘆一條狀 鏈，含糖量為11. 4%，等電點為4. 8。這種酶比哺乳動物中絲氨酸型蛋白酶有更^廣泛的底 物，能水解精氨酸酯和賴氨酸酯，但水解前種底物的活性較高，它不能水解酪氨酸酯。DFP 可以同時抑制它的精氨酸酯酶和毛細血管通透性增加活性，說明這種酶是以絲氨酸作為 活性中心的絲氨酸蛋白酶。對它的最適pH和熱穩定性也作了大致的研究，該酶在pH7? 9范圍內穩定，在5(TC以上酶失去活性。在從九蛇毒中分離出毛細血管通透 性增加因子的同時，Ohtaini等(1988)還從該蛇毒中分離出一種激肽釋放酶，在PH8. 3條 件下用PAGE法和SDS-PAGE法測定為純品。該酶無酪蛋白水解活性和促凝活性，但能 從牛高分子量激肽原中釋放出舒緩激肽。把這種蛋白質注入到家兔皮內會增加毛細血管 的通透性。一般認為它的增加毛細血管通透性作用與它的舒緩激肽釋放作用有關。對該 酶的物理化學性質進行研究發現，該釋放酶是含糖的單鏈肽，糖的含量為10. 1%，分子量 為33 500,由274個氨基酸殘基組成，等電點為3.5。釋放酶水解精氨酸酯的速度比水解 賴氨酸酯快，不能水解酪氨酸酯。DFP能抑制它的精氨酸酯酶活性，也能抑制從牛高分子 量激肽原中釋放激肽，這說明該酶的活性部位有絲氨酸殘基。該酶還能水解PNA,H . D . Phe-Pipecolyl-Arg-PNA、H .Pro-Phe-Arg-PNA、H *D .Val-Leu-Arg-PNA 和 Pro-Phe-Arg-4-Methylcoumary-7-Amide,這說明這種酶的底物比動物中的絲氨酸蛋白 酶更少。

Schwartz等（1985)從Crote/w5 蛇毒中分離出兩種酶，這兩種酶的氨基酸含量相似，都含有糖類，分別稱為AAE I和AAE I，它們的最適pH值在 8. 0?8. 5范圍內，都不能水解酪蛋白、血紅蛋白和BAPNA，但都能水解BAME、TAME 和Ac-Phe-Arg-OMe。酶的活性可以被絲氨酸修飾劑和苯甲酰胺抑制，但EDTA和大豆 胰蛋白酶抑制劑不抑制其活性。兩種酶都無類凝血酶活性，但都能釋放激肽，這可以通過 分離的小鼠子宮收縮來證明。AAE I和AAE I的N-端氨基酸順序相同，而且與從其他響 尾蛇毒中分離出來的精氨酸酯酶相似。

Samel等(1987)從極北蜂(V7/>ct"<2 term)蛇毒中分離出兩種精氨酸酯水解酶，命名為E I和EI。這兩種酶都是由同工酶組成的混合物，E I的等電點在4.0?4. 6范圍 內，£1的等電點在3.3?3.9范圍內。同工酶的分子量相等，用303^八0£測定£1分子 量為38 500，En分子量為41 000。兩種酶的N末端氨基酸都為纈氨酸，它們的氨基酸含 量也十分相似，都含有糖類。如用神經氨酸酶處理E I和E I后，兩種酶在等電聚焦電泳 系統中的遷移速度相近。這兩種酶對酪蛋白和BAPNA都無水解作用，但都能水解 BAEE、TAME和Pro-Phe-Arg-ACA。它們的酯酶活性可以被有機磷和苯甲酰胺抑制，大